小鼠Biccl基因的克隆、Biccl多克隆抗体制备及蛋白定位与表达的研究

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:asfdasdfasd
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双尾-C基因(Bicaudal-C)首先在果蝇(Drosophila melanogaster)中发现,其功能丧失导致果蝇胚胎滤泡细胞的错误迁移、头部的缺失和双尾结构的形成。后来发现多个物种都含有Bicaudal-C的同源基因,其中小鼠中的同源基因Bicc1的缺失导致小鼠产生肾脏等脏器的病变,其症状与人类多囊肾疾病高度相似,但其具体机制还不清楚。   本研究以小鼠肾脏组织总RNA为模板体外反转录为cDNA,通过分段巢式PCR及酶切连接的方法获得了全长约3Kb的小鼠Bicc1 cDNA序列。   根据生物信息学分析全长的Bicc1蛋白,选择两个免疫原性较好的区段作为抗原位点构建相应的原核表达载体;IPTG诱导表达并纯化融合蛋白,制备两种兔抗Bicc1蛋白多克隆抗体,并通过Western blot证实这两种抗体具有高度特异性。   用细胞免疫荧光方法及免疫组织化学方法对该蛋白的定位做了一些初步研究。发现Bicc1蛋白定位于体外培养的小鼠肾细胞的细胞质内,并在胚胎发育于期表达仅在心脏,后来逐步地在多个组织器官内出现,并在出生后的小鼠体内表达稳定。Bicc1 mDNA也表达于多个器官内,并且在肾脏中有明显较高的表达量。   通过搜索和比对,筛选到了的3个针对Bicc1基因的RNAi的序列,通过荧光强度改变和Western blot鉴定出其中两个序列能明显降低Bicc1蛋白在体外培养细胞中的表达水平,为下一步建立稳定的细胞株奠定了良好的基础。
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