目的:疫苗作为免疫疗法中备受关注的一员,在疾病的预防以及治疗中广受青睐。疫苗是通过激活体内的免疫系统,使机体产生相应的抗体以及细胞因子杀伤抗原起作用的;同时,机体会产生记忆细胞;相同的抗原进入体内时,记忆细胞迅速分化为浆细胞和效应T细胞,从而清除抗原。识别过程是免疫应答过程中的重要一环;由于包括某些多肽抗原在内的多种抗原属于非T细胞依赖性抗原,其本身在体内有少量的表达,这些抗原在进入体内时容易被免疫系统识别为自身的成分,从而不能引起有效的免疫应答。因此,如何提高这些抗原被免疫系统识别和摄取能力,是目前疫苗发展面临的重要挑战。β-环糊精主客体识别作用主要是通过主体分子和客体分子之间的非共价结合进行的。基于β-环糊精主客体自组装的系统已经在药物输送方面有着广泛的应用,研究证明,基于β-环糊精主客体自组装分子可以改善药物的疗效和靶向性,通过共价键引入糖苷键的金纳米颗粒载体能够很好地提高抗原免疫原性;但目前尚未见有关于β-环糊精主客体自组装系统应用于疫苗的报道。为了提高抗原的免疫原性,使抗原可以被免疫系统有效识别摄取,我们利用β-环糊精主客体自组装作用制备一种新型的纳米疫苗载体,通过非共价键作用实现抗原与载体之间的可逆结合。为了评价基于β-环糊精主客体自组装疫苗的免疫效果,我们首先选用一个模式抗原（FFRKSIINFEKL）在小鼠身上进行抗体滴度检测;然后,在此基础上,为了探索这个疫苗载体是否可以应用于抗肿瘤领域,我们选用一个抗肿瘤多肽抗原NY-ESO-1157-165（SLLMWITQC）,在小鼠黑色素瘤模型上对疫苗的肿瘤防治作用进行评价。结果表明基于β-环糊精主客体自组装疫苗不仅可以产生高滴度的抗体,同时对黑色素瘤的治疗有显著疗效,证明这个疫苗载体能够有效提高抗原的免疫效果,本课题的研究为新型疫苗载体的开发提供依据。方法:1.非共价键糖基化多肽纳米疫苗的制备通过化学修饰将β-环糊精连接到金纳米颗粒上作为主体分子,将抗原连接到金刚烷羧酸上作为客体分子,在水溶液中,二者通过主客体作用结合;所得反应液与弗氏佐剂混合制备成乳化剂免疫小鼠。合成的化合物通过核磁、质谱、红外、电镜、动态光散射等分析方法鉴定其结构。2.考察疫苗对小鼠的免疫效果在雌性C57BL6/J小鼠中以7天为间隔皮下注射纳米疫苗（含15.5 nmol FFRKSIINFEKL抗原）,共注射4次,以多肽作为对照。于14,21,28天收集两组小鼠外周血,离心获得血清。通过ELISA法对血清中的抗体滴度进行测定。3.考察给药剂量与免疫效果的关系纳米疫苗组和多肽对照组在相同时间间隔注射高剂量疫苗（抗原给药剂量是低剂量疫苗的两倍,即含31 nmol FFRKSIINFEKL抗原）。两组小鼠血清中的抗体滴度通过ELISA法测定并与低剂量组的抗体滴度进行比较。4.非共价键糖基化多肽纳米疫苗对黑色素瘤的预防作用在雌性C57BL6/J小鼠中,在0,7,14,21天皮下注射纳米疫苗（含31 nmol SLLMWITQC抗原）和多肽疫苗,在35天皮下接瘤B16-F10细胞,比较各组小鼠间肿瘤细胞体积、体重变化以及生存期。5.非共价键糖基化多肽纳米疫苗对黑色素瘤的治疗作用在雌性C57BL6/J小鼠中,皮下接瘤B16-F10细胞,在接种肿瘤细胞后第7天开始,以7天为间隔皮下注射纳米疫苗（含31 nmol SLLMWITQC抗原）和多肽疫苗;比较各组小鼠间肿瘤细胞体积、体重变化以及生存期。结果:1.非共价键糖基化多肽纳米疫苗的制备我们成功地合成非共价键糖基化多肽纳米疫苗并对其进行了一系列的表征。从1H-NMR、质谱、红外等表征中,通过Ar-H,-SH等特征峰确认中间产物Tosyl-βCD、β-CD-SH已经成功合成。β-CD-SH修饰的金纳米颗粒（β-CD-Au）通过电镜分析确认其粒径为10 nm,在负载与金刚烷羧酸连接的抗原后,粒径增大至300 nm。2.考察疫苗对小鼠的免疫效果小鼠在注射纳米疫苗后,能产生高滴度的,具有高亲和力的IgG抗体,能在长时间维持较高的IgG抗体滴度并与多肽组有显著差异。此外,纳米疫苗诱导机体产生的IgM、Kappa抗体滴度显著高于多肽组。3.考察给药剂量与免疫效果的关系与低剂量疫苗相比,高剂量疫苗能诱发更高强度的IgG、IgM、Kappa抗体。IgG亚型分析表明接受纳米疫苗能产生更高滴度的IgG1、IgG2b抗体。4.非共价键糖基化多肽纳米疫苗对黑色素瘤的预防作用在肿瘤预防模型中,接受纳米疫苗注射的小鼠肿瘤增长速度显著低于接受PBS以及接受多肽疫苗小鼠的肿瘤增长速度。在生存期分析中,多肽组和纳米疫苗组小鼠荷瘤生存时间较长,然而,多肽组和纳米疫苗组小鼠荷瘤生存时间无明显差别;多肽组和纳米疫苗组小鼠体重早期保持不变,空白对照组小鼠体重有轻微下降;在第11天后三组小鼠体重呈增长趋势,三组小鼠体重总体差异不明显。5.非共价键糖基化多肽纳米疫苗对黑色素瘤的治疗作用在肿瘤治疗组模型中,刚接种肿瘤细胞初期,多肽组和纳米疫苗组小鼠体积增长无显著差异,从第14天开始,两组间的差异逐渐明显,纳米疫苗组小鼠肿瘤体积增长速度稍低于多肽组小鼠,与空白对照组相比,纳米疫苗组小鼠体积增长明显较缓慢。但是,与肿瘤预防组相比,在治疗组实验中,纳米疫苗对黑色素瘤的抑制作用稍逊;而肿瘤治疗组小鼠生存期与肿瘤预防组小鼠相仿。三组小鼠体重总体差异不明显。结论:本论文首次报道了一种新型的、利用β-环糊精主客体识别作用的多肽纳米疫苗。研究表明,纳米材料的粒径与其被抗原提呈细胞（APCs）的能力息息相关。若粒径过小,在10nm以下时,抗原直接进入淋巴结,不会引起机体产生免疫应答;当纳米粒径大于500nm时,抗原难以被抗原提呈细胞摄取,只能停留在注射部位[1-4]。β-CD-SH修饰的金纳米颗粒（β-CD-Au）在负载与金刚烷羧酸连接的抗原后,粒径为300nm,容易被吞噬细胞或者树突状细胞摄取。通过初步的免疫活性实验,我们发现接受了纳米疫苗的小鼠可以产生高滴度、高亲和力的抗体,抗体滴度比多肽对照组高,同时,当我们将抗原的给药剂量增加一倍时,发现高剂量疫苗可以诱导机体产生更高滴度的抗体,证明高剂量的非共价键糖基化多肽纳米疫苗的免疫疗效更好。在对IgG抗体亚型的分析中,我们发现IgG1的抗体滴度最高,表明该疫苗诱导的免疫应答是多肽特异性的。在对黑色素瘤的防治作用的探索中,我们发现,该纳米疫苗对黑色素瘤的增长有显著抑制作用,证明基于β-CD主客体自组装作用的疫苗载体能有效地提高抗原的免疫效果。