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【目的】:
本课题组前期研究显示PM2.5可降低肺表面活性蛋白A(SP-A)表达,但具体分子机制尚不清楚。本研究拟在动物和细胞水平上探讨不同浓度PM2.5对SP-A蛋白的影响及可能机制。
【方法】:
1.PM2.5的采集和配制。
2.BALB/c小鼠随机分成对照组、PM2.5毒染组、NAC+PM2.5组。PM2.5毒染组包括1μg组、10μg组、50μg组、100μg组。对照组采用生理盐水替代PM2.5。PM2.5毒染组采用气管滴注PM2.5。NAC+PM2.5组,即100μg组PM2.5毒染前12h行气管滴注抗氧化剂NAC。毒染24h后,收集肺组织,HE染色观察组织病理变化,透射电镜观察板层小体结构变化,qRT-PCR和WB分别检测SP-A的mRNA和蛋白表达水平。
3.A549细胞分成对照组、PM2.5毒染组、NAC+PM2.5组。PM2.5毒染组分成25μg组、50μg组、75μg组、100μg组。NAC+PM2.5组,即毒染前12h加入NAC。毒染24h后,流式细胞仪检测ROS含量,qRT-PCR和WB分别检测SP-A的mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测SP-A蛋白翻译后运输过程。
【结果】:
1.SP-A表达水平的变化:在A549和小鼠肺中,与对照组比较,随着PM2.5浓度增加,SP-A蛋白先升后降;在A549细胞中,SP-AmRNA呈现与其蛋白相同的趋势,但100μg/mlPM2.5处理后SP-A蛋白减少程度明显比mRNA严重,提示高浓度PM2.5有可能破坏SP-A蛋白翻译或者翻译后过程。
2.SP-A蛋白翻译后运输过程的变化:免疫荧光显示在A549细胞上对照组SP-A与LB标志蛋白CD63存在明显的共定位;50μg/mlPM2.5处理后SP-A与CD63共定位程度降低;100μg/mlPM2.5处理后SP-A与CD63基本不存在共定位,两种蛋白的荧光强度也极弱。提示PM2.5浓度升高有可能损害SP-A运输至LB的过程。
3.肺组织病理切片、LB超微结构的变化:HE染色结果显示随着PM2.5浓度的增加,肺泡大小结构分布不均匀程度增加,支气管周围炎性细胞浸润程度增加;电镜结果显示,随着PM2.5浓度增加,可见细胞核不规则加重,边境模糊,LB数量逐渐减少,排空或者破溃加剧。
4.细胞内ROS的变化以及对LB和SP-A的影响:PM2.5毒染A549细胞24h后,随着PM2.5浓度的增加,ROS上升;毒染前12h加入NAC有效降低胞内ROS水平,挽救了LB遭受高浓度PM2.5的损害和SP-A蛋白的减少。
【结论】:
低浓度PM2.5能诱导SP-A蛋白表达上升,高浓度PM2.5降低SP-A蛋白表达水平。高浓度PM2.5可通过诱导ROS破坏板层体结构,可能损害SP-A蛋白翻译后运输成熟过程,从而降低肺泡上皮Ⅱ型细胞内SP-A蛋白的表达水平。
本课题组前期研究显示PM2.5可降低肺表面活性蛋白A(SP-A)表达,但具体分子机制尚不清楚。本研究拟在动物和细胞水平上探讨不同浓度PM2.5对SP-A蛋白的影响及可能机制。
【方法】:
1.PM2.5的采集和配制。
2.BALB/c小鼠随机分成对照组、PM2.5毒染组、NAC+PM2.5组。PM2.5毒染组包括1μg组、10μg组、50μg组、100μg组。对照组采用生理盐水替代PM2.5。PM2.5毒染组采用气管滴注PM2.5。NAC+PM2.5组,即100μg组PM2.5毒染前12h行气管滴注抗氧化剂NAC。毒染24h后,收集肺组织,HE染色观察组织病理变化,透射电镜观察板层小体结构变化,qRT-PCR和WB分别检测SP-A的mRNA和蛋白表达水平。
3.A549细胞分成对照组、PM2.5毒染组、NAC+PM2.5组。PM2.5毒染组分成25μg组、50μg组、75μg组、100μg组。NAC+PM2.5组,即毒染前12h加入NAC。毒染24h后,流式细胞仪检测ROS含量,qRT-PCR和WB分别检测SP-A的mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测SP-A蛋白翻译后运输过程。
【结果】:
1.SP-A表达水平的变化:在A549和小鼠肺中,与对照组比较,随着PM2.5浓度增加,SP-A蛋白先升后降;在A549细胞中,SP-AmRNA呈现与其蛋白相同的趋势,但100μg/mlPM2.5处理后SP-A蛋白减少程度明显比mRNA严重,提示高浓度PM2.5有可能破坏SP-A蛋白翻译或者翻译后过程。
2.SP-A蛋白翻译后运输过程的变化:免疫荧光显示在A549细胞上对照组SP-A与LB标志蛋白CD63存在明显的共定位;50μg/mlPM2.5处理后SP-A与CD63共定位程度降低;100μg/mlPM2.5处理后SP-A与CD63基本不存在共定位,两种蛋白的荧光强度也极弱。提示PM2.5浓度升高有可能损害SP-A运输至LB的过程。
3.肺组织病理切片、LB超微结构的变化:HE染色结果显示随着PM2.5浓度的增加,肺泡大小结构分布不均匀程度增加,支气管周围炎性细胞浸润程度增加;电镜结果显示,随着PM2.5浓度增加,可见细胞核不规则加重,边境模糊,LB数量逐渐减少,排空或者破溃加剧。
4.细胞内ROS的变化以及对LB和SP-A的影响:PM2.5毒染A549细胞24h后,随着PM2.5浓度的增加,ROS上升;毒染前12h加入NAC有效降低胞内ROS水平,挽救了LB遭受高浓度PM2.5的损害和SP-A蛋白的减少。
【结论】:
低浓度PM2.5能诱导SP-A蛋白表达上升,高浓度PM2.5降低SP-A蛋白表达水平。高浓度PM2.5可通过诱导ROS破坏板层体结构,可能损害SP-A蛋白翻译后运输成熟过程,从而降低肺泡上皮Ⅱ型细胞内SP-A蛋白的表达水平。