bcr/abl融合基因是慢性粒细胞白血病（Chronic myloid leukemia，CML）的分子标志，该基因表达具有组成型激活的酪氨酸激酶活性的Bcr/Abl融合蛋白，能够异常活化PI3K-AKT、Ras和STAT5等一系列信号通路，使血细胞恶性增殖和凋亡受阻。除此以外，Bcr/Abl融合蛋白表达的细胞中还能检测到热休克蛋白70（Hsp-70）表达水平增高， Hsp-70作为细胞应激时的保护蛋白，近年来在肿瘤的发生发展过程中受到广泛关注。Hsp-70可抑制Bax的线粒体定位，从而抑制线粒体通路的细胞凋亡；也可在线粒体下游抑制Apaf-1对caspase-9的募集作用，从而阻断caspase凋亡通路的活化。此外，Hsp-70还能抑制非caspase凋亡通路。凋亡诱导因子（Apoptosis-inducing factor，AIF）是非caspase凋亡途径的重要分子，生理条件下，AIF表达后依赖其N端1-120的线粒体定位信号（MLS）定位于线粒体，辅助呼吸链的电子传递。凋亡发生时，AIF易位至细胞核中，诱发基因组DNA断裂，促进细胞凋亡。在MEF细胞中，外源性过表达Hsp-70能够阻断AIF的细胞核定位，从而中和其促凋亡效应。AIF的150-226作为Hsp-70结合位点，介导 AIF与Hsp-70直接结合，这两者之间的相互作用可能是Hsp-70影响AIF功能的主要途径。　　鉴于目前Hsp-70对AIF负性调节作用的研究基础，和作者所研究的CML细胞中Hsp-70内源性过表达，我们推测，AIF及其所负责的非caspase凋亡通路在CML细胞中处于失活状态，该状态与CML的发病机制可能有关。为了证明这一推测，我们拟提出以下研究思路和方法：　　首先，我们研究细胞在受到凋亡刺激时非caspase途径的活化状态以及AIF的功能。K562、32Dp210、Ba/F3p210以及各自的Bcr/Abl阴性对照细胞HL-60、32D、Ba/F3接受caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理阻断caspase通路后，采用化疗药物Vp-16诱导凋亡。采用FCM定量分析细胞凋亡，以验证非caspase通路在各细胞中的活化能力。通过western blotting和IFT方法检测内源性AIF的亚细胞定位。同时，在K562细胞中表达外源性携带HA标签的AIF突变体，该突变体缺失1-120氨基酸残基的线粒体定位序列（dMLS-AIF），能够靶向细胞核并起始凋亡。通过western blotting和IFT检测外源性AIF的亚细胞定位，流式细胞术和瑞氏染色检测细胞凋亡。　　其次，我们研究Bcr/Abl细胞Hsp-70的表达及其对AIF的影响。采用western blotting比较三株Bcr/Abl细胞、临床CML病人骨髓细胞以及相应的Bcr/Abl阴性对照细胞中的Hsp-70表达。通过酪氨酸酶抑制剂伊马替尼（IM）处理细胞抑制Bcr/Abl蛋白激酶活性后检测Hsp-70的表达变化以及其转录因子Hsf-1的活化水平。为证明Hsp-70的水平影响AIF的定位，我们通过siRNA靶向沉默Hsp-70，采用CCK-8和FCM检测细胞增殖、周期及凋亡。随后在Vp-16诱导下，通过western blotting和IFT检测AIF的亚细胞定位，并通过FCM和TEM方法检测caspase途径被抑制后细胞的凋亡。　　最后，我们研究Hsp-70抑制AIF促凋亡功能的机制。通过co-IP检测Bcr/Abl细胞在细胞凋亡时过表达的Hsp-70与释放的AIF的结合，以及K562细胞中Hsp-70与外源性HA标记的AIF突变体(dMLS-AIF)的结合。并通过pull-down检测不同细胞胞浆蛋白中Hsp-70与原核表达的AIF(HIS-AIF)蛋白的结合，以证明Hsp-70结合AIF的能力与其表达水平相关。为了证明AIF与过表达的Hsp-70结合是其入核受阻的原因，我们构建了缺失Hsp-70结合域的AIF突变体（dHBD-AIF）以破坏两者之间的相互作用，腺病毒介导在K562细胞中表达，采用co-IP验证其不能与Hsp-70结合，western blotting和IFT检测其亚细胞定位，最后通过FCM以及TEM分析dHBD-AIF诱导细胞凋亡的能力。　　研究结果如下：　　首先，Bcr/Abl细胞接受caspase抑制预处理后，Vp-16诱导的细胞凋亡完全受到抑制，而对照组细胞接受caspase抑制预处理后，凋亡率虽然下降，但仍明显高于空白对照组。说明在Bcr/Abl细胞中，非caspase通路处于失活状态。AIF是非caspase通路的重要分子，Bcr/Abl细胞中，Vp-16未能诱导AIF入核：IFT核western blotting结果均显示，AIF主要定位于细胞浆中，而Bcr/Abl阴性对照细胞中，AIF则明显在细胞核中聚集。同时，缺失线粒体定位信号的AIF突变体（dMLS-AIF）也主要在K562细胞胞浆中表达。　　其次，在K562、32D p210和Ba/F3p210三株细胞中，Hsp-70的水平是其Bcr/Abl阴性对照细胞HL-60、32D和Ba/F3的4-6倍；与正常人相比，CML病人骨髓细胞Hsp-70上调可高达上百倍。上调的Hsp-70与Bcr/Abl蛋白有关，IM处理可通过抑制Hsf-1活性下调Hsp-70的水平，且表现出时间与浓度的依赖性。siRNA抑制Hsp-70后，结果显示，细胞的生物学特征的改变与Hsp-70沉默效果相关，Hsp-70的沉默效果达到80％时，细胞周期受抑，凋亡增加；沉默效果达到60%时，仅细胞增殖受到影响，未有明显的凋亡发生；10-20%沉默效果未能引起明显生物学行为改变。Hsp-70沉默亦可增加Bcr/Abl细胞对Vp-16的敏感性：Hsp-70沉默组的细胞在Vp-16作用下凋亡率明显高于阴性对照组，Hsp-70沉默后，Vp-16能够成功诱导内源AIF以及外源dMLS-AIF入核。　　最后，与对照组相比，Bcr/Abl细胞中高表达的Hsp-70能够结合凋亡诱导时释放的AIF，K562细胞中外源表达的dMLS-AIF亦可与Hsp-70结合。因不同细胞中Hsp-70表达量的差异，所结合的AIF也不同，与K562、32D p210细胞的胞浆蛋白共孵育的His-AIF蛋白主要呈结合状态，而与HL-60、32D胞浆蛋白共孵育后，His-AIF蛋白主要存在于穿梭液中。同时，外源表达dHBD-AIF能够破坏与Hsp-70的结合，dHBD-AIF定位于胞核中，并诱导细胞凋亡，在形态学上可见细胞的凋亡发生在染色质边集化的早期阶段。　　综上所述，Bcr/Abl细胞异常表达的Hsp-70通过结合AIF抑制非caspase凋亡通路的活化，下调Hsp-70可以抑制细胞增殖且促进凋亡的发生，同时也恢复AIF的核定位能力，提高了细胞对药物的敏感性。通过研究非caspase依赖的凋亡通路及其重要分子，丰富我们对CML细胞逃避凋亡的认识，也为治疗CML提供新的思路。