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[研究背景]病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是儿童最常见的后天性心脏病之一,急性期可以因心源性休克、急性心力衰竭或严重心律失常而导致患儿死亡,迁延发作可以导致左心室功能障碍或扩张型心肌病。病毒性心肌炎是由于病毒感染和/或病毒感染后介导的免疫反应导致的心脏炎性病变。多种病毒感染均可导致疾病发生,其中最常见的为柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3, CVB3)。CVB3是小核糖核酸病毒科家族中的一种微小、无包膜、正链RNA肠道病毒,对心肌细胞有高度亲和力,其导致病毒性心肌炎的病因机制主要包括：病毒的直接损伤、细胞介导的免疫反应、炎性因子的参与、诱导心肌细胞凋亡、抗心肌自身抗体作用以及导致心肌胶原重构等,其中细胞凋亡在CVB3所致的病毒性心肌炎的发病过程当中占有至关重要的地位。因此,凋亡机制的研究,也为病毒性心肌炎防治的研究开辟了一条新的途径。调控或参与凋亡的信号途径众多,到底哪些途径主导了CVB3所致的病毒性心肌炎细胞的凋亡,他们又是怎样起作用的,目前尚不明确。研究发现,磷脂肌醇3-激酶-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路在CVB3所致的病毒性心肌炎中发挥重要作用,并且该通路是调控细胞凋亡的关键途径之课题组前期工作业已证实PI3K/Akt/mTOR信号通路参与了心肌细胞凋亡的调控,但其具体分子机制尚未完全阐明。[目的]该课题拟在前期研究的基础上,以HeLa细胞为模型,通过对PI3K/Akt/mTOR信号系统中不同调控节点的干预,探讨CVB3通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞凋亡的机制,旨在为CVB3导致病毒性心肌炎的发病机制,尤其是导致细胞凋亡的机制方面提供更为详实的实验数据。[方法]利用HeLa细胞作为扩增CVB3病毒的载体,扩增收获的病毒进行滴度测定后,将HeLa细胞作为研究CVB3病毒感染细胞的有效模型,同时探讨P13K的抑制剂LY294002和mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin),加入病毒感染HeLa细胞的时间梯度实验体系中,通过流式细胞术等,研究以LY294002抑制P13K后和Rapamycin抑制mTOR之后,CVB3感染HeLa细胞所引起的细胞凋亡等现象的改变。利用免疫细胞化学、Real time PCR和Western Blot等方法,研究相关信号通路上关键分子的表达变化情况。[结果](1)CVB3感染对HeLa细胞凋亡的影响：在HeLa细胞中扩增CVB3并进行病毒滴度测定后,选取100TCID50(按Reed-Muench法测定通过病毒的50%组织细胞感染指数TCID50=10-5)病毒感染HeLa细胞。接种病毒后的HeLa细胞爬片组从6h开始出现细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),病毒接种48h后,细胞病理形态改变更为显著,病变细胞数目显著增多,至72h病变细胞数占全部细胞数的40%左右。对照组HeLa细胞生长情况和形态表现在各个时间点均无显著变化。采用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪检测不同时间点CVB3感染组与对照组HeLa细胞的凋亡情况,结果显示自病毒感染后12h起,HeLa细胞的凋亡率已显著高于对照组,且随着培养时间的延长,被感染细胞凋亡率逐渐升高,至48h达高峰,其后则趋于稳定。CVB3感染后,HeLa细胞中Akt与mTOR蛋白表达量下降。(2)LY294002抑制P13K对CVB3感染的HeLa细胞及下游分子表达和磷酸化的影响：10μM及以上的LY294002对HeLa细胞P13K表达有显著抑制作用。用浓度为10μM的LY294002处理CVB3感染的HeLa细胞,HeLa细胞出现形态学改变较单纯CVB3感染的HeLa细胞更为显著,其凋亡率显著升高,表明LY294002可能导致了细胞凋亡的增加。CVB3感染HeLa细胞后,Akt、mTOR mRNA表达水平及Akt、p-Akt与mTOR、p-mTOR蛋白表达水平随时间延长呈逐渐下调趋势；而经LY294002处理的CVB3感染HeLa细胞,随着LY294002作用时间延长,细胞中Akt与mTOR mRNA表达水平较单纯CVB3感染呈现更为显著的下调,Akt、p-Akt与mTOR、 p-mTOR蛋白表达水平亦呈相应下调,且下调水平较单纯CVB3感染更为显著。(3)雷帕霉素(Rapamycin)抑制mTOR对CVB3感染的HeLa细胞及下游分子表达和磷酸化的影响：10nM及以上的Rapamycin对HeLa细胞mTOR表达有显著抑制作用。用浓度为10nM的Rapamycin处理CVB3感染的HeLa细胞,发现HeLa细胞出现形态学改变的比率及凋亡率均较单纯CVB3感染的HeLa细胞显著升高,提示Rapamycin亦可导致细胞凋亡的增加。CVB3感染HeLa细胞后mTOR的下游分子4EBP1与P70S6K mRNA水平表达下调,4EBP1、p-4EBP1与P70S6K、p-P70S6K蛋白水平表达下调,而经Rapamycin干预后上述分子的表达水平进一步下调,较未感染组及单纯CVB3感染组均有显著性差异。[结论](1)CVB3感染可导致HeLa细胞凋亡增加,呈剂量与时间依赖性。(2)CVB3感染可抑制HeLa细胞中的PI3K/Akt/mTOR信号而诱导细胞凋亡。(3)PI3K抑制剂LY294002可阻断PI3K/Akt/mTOR信号从而促进CVB3感染的HeLa细胞凋亡。(4) mTOR抑制剂Rapamycin通过阻断mTOR/4EBP1及mTOR/P70S6K通路促进CVB3感染的HeLa细胞凋亡。(5)在PI3K/Akt/mTOR信号系统中,抑制PI3K或mTOR任何一环均可促进CVB3感染的HeLa细胞凋亡,并且这种促凋亡效应可能是通过下游分子4EBP1与P70S6K的磷酸化实现的。