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由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)引起的猪传染性胸膜肺炎造成了世界养猪业的重大经济损失,其最重要的毒力因子之一是胸膜肺炎放线杆菌外毒素(Apx)。Apx毒素属于RTX毒素家族,是Ca2+依赖性的溶血素,有的还同时具有细胞毒素作用。到目前为止,已经在胸膜肺炎放线杆菌的15个血清型菌株中发现了四种Apx毒素,即ApxⅠ、ApxⅡApxⅢ和ApxⅣ。Apx毒素一般由C、A、B、D四个基因组成的操纵子编码,A基因编码结构蛋白并能被C基因的编码产物激活,B和D基因的编码产物参与毒素蛋白的分泌。由RTX毒素引发的细胞死亡主要有两种方式,即细胞凋亡和细胞坏死。以往的研究表明,高浓度的RTX毒素能导致靶细胞迅速死亡并伴随细胞坏死的特征,而当靶细胞接触低浓度的RTX毒素时呈现出细胞凋亡的的形态学、生化和分子变化特征。由于Apx的复杂性,Apx与靶细胞之间的相互作用目前还不清楚。本论文初步研究了ApxⅠ、ApxⅡ与猪外周血白细胞、猪肺上皮细胞之间的相互作用。Apx毒素引起猪外周血白细胞凋亡：利用常规方法提取猪胸膜肺炎放线杆菌血清10型的天然毒素ApxⅠ和血清7型的天然毒素ApxⅡ,并制备了重组蛋白rApxⅠA。分别设置天然毒素ApxⅠ组、天然毒素ApxⅡ组、重组蛋白rApxⅠA组、三种蛋白的caspase广谱抑制剂组、三种蛋白的caspase-3抑制剂组以及三种蛋白的caspase-9抑制剂组,然后分别设置时间梯度和浓度梯度,作用于猪外周血白细胞,用DNA ladder方法检测其凋亡并分析其凋亡途径。实验结果显示,ApxⅡ引起的白细胞凋亡是通过caspase-9和caspase-3共同激活途径,而ApxⅠ毒素和重组蛋白rApxⅠA在较低浓度时未能引起白细胞凋亡Apx毒素引起猪肺上皮细胞凋亡：分别设置天然毒素ApxⅠ组、重组蛋白rApxⅠA组、两种蛋白的caspase广谱抑制剂组、两种蛋白的caspase-3抑制剂组以及两种蛋白的caspase-9抑制剂组,然后分别设置时间梯度和浓度梯度作用SJPL猪肺上皮细胞,用DNA ladder方法检测其凋亡并分析其凋亡途径。实验结果显示,ApxⅠ引起SJPL细胞凋亡是通过caspase-3激活途径,而rApxⅠA不引起SJPL细胞发生凋亡现象。抗生素对ApxⅠ致猪肺上皮细胞凋亡的影响：以往研究表明,长期在抗生素培养条件下的细胞常常会出现生理生化特性的微小变化。为了研究此现象是否对凋亡产生作用,我们将猪肺上皮细胞分成两组,一组用“双抗”培养5代,另一组不用抗生素培养,然后用天然毒素ApxⅠ分别作用两组细胞,检测抗生素是否会对靶细胞凋亡产生影响。实验结果显示,在抗生素培养下的细胞呈现出凋亡延迟现象,而且毒素作用浓度的高低对细胞凋亡的延迟时间也有影响。