森林草莓Fragaria vesca(F.vesca)因其基因组较小(2n=14,240Mb基因组)，生殖周期较短，容易成活，可依靠种子和匍匐茎等繁殖，以及容易转化的优点，使其成为研究蔷薇科功能基因组学以及非呼吸越变果实发育与成熟等方向的模式植物之一。脱落酸(ABA)已证实在草莓果实的发育和成熟过程中起着重要作用。近年来，尽管在模式植物森林草莓中关于ABA信号通路关键因子对草莓果实发育成熟的影响取得了突破性的进展，但大都是采用喷施、注射以及浸泡等瞬时转化方法，通过抑制或增强基因的表达量来探讨ABA信号通路上关键因子对草莓果实发育和成熟的影响，而没有采用稳定转化方法进行研究。因此，我们希望借助植物组织培养和CRISPR/Cas9技术，将CRISPR/cas9植物表达载体导入草莓外植体内。通过植物组织培养技术，建立草莓ABA信号通路相关基因突变体库，以进一步研究ABA信号通路上各组分对草莓果实发育与成熟的影响。为将来研究植物激素信号通路和草莓果实发育提供一些参考和依据。主要研究内容和结果如下：
　　1.选取ABA信号通路中关键因子：FvePYR/PYL/RCAR、FvePP2C、FveSnRK2、FveABI4、FveABI5、FveNCED5、FveBG3和FveUGT，分别在靠近基因序列的5’端和蛋白功能域各选择一个合适的sgRNA，再以质粒pCBC-DT1T2和pHSE401为材料，构建CRISPR/cas9载体。结果显示，重组质粒构建成功，sgRNA片段正确且未产生任何碱基突变。
　　2.因为稳定的植物组织培养往往需要较长时间，所以在进行植物组织培养之前有必要对我们所构建的CRISPR载体和设计的靶点进行检测。通过农杆菌介导法将构建好的CRISPR/cas9载体瞬时注射烟草叶片，因为CRISPR/cas9载体中插入了GFP片段，所以结果显示在烟草细胞中荧光全部表达。研究结果间接说明CRISPR/cas9载体构建成功。再选择FveABI5、FveNCED5基因继续通过农杆菌介导法将构建好的CRISPR/cas9载体瞬时注射RS1时期（授粉后第22～24天）的二倍体草莓果实。7天之后在体式显微镜下观察果实荧光，发现被注射的RS1时期80%的果实含有荧光。继续将注射后带有GFP荧光的草莓果实提取DNA，并PCR扩增包括两个sgRNA在内的DNA序列，将PCR产物连接T载体，转化大肠杆菌感受态，随机挑选一定数量的单克隆测序。结果发现在sgRNA处发生编辑，编辑类型有碱基替换、碱基插入、单碱基缺失和大片段缺失，其中以缺失为主。综合以上实验结果表明，可以选择在二倍体草莓RS1时期瞬时注射CRISPR/cas9载体来验证所构建的载体是否成功以及选择的靶点sgRNA是否发挥编辑作用。
　　3.以森林草莓‘Yellor Wonder’的叶片为外植体，建立的草莓CRISPR/cas9技术应用的遗传转化体系为：叶片预培养7～10天；使用菌液浓度为OD600=0.6的农杆菌GV3101悬浮液侵染叶盘组织30分钟；无菌水清洗3次后放在含有无菌滤纸的共培养基上暗培养3天；再次无菌水清洗叶盘组织3次，转入含250mg/L的羧苄和250mg/L的特美汀的延迟培养基上暗培养1～2周；之后转移到含250mg/L的羧苄、250mg/L的特美汀以及2mg/L潮霉素的筛选培养基上继续选择性培养。