我国是世界最大的猪肉生产和消费国,2019年猪肉消费量达4486.6万吨,居世界首位。2020年,我国肉类产量高达7519万吨;其中,猪肉产量4225万吨,位居第一。随着经济的快速发展与生活水平的提高,消费者更倾向于选择色泽好、嫰度高、瘦肉率高的优质猪肉。其中,脂肪沉积是影响猪肉品质的重要因素之一,猪肉中脂肪含量直接关系到猪肉的风味、口感。同时,畜牧生产中猪脂肪沉积过多会增加胴体脂肪率,影响繁殖性能,降低饲料的利用效率等。因此,猪脂肪的合理沉积是促进我国生猪养殖可持续发展的重要因素之一。支链氨基酸（BCAA）是一类分子结构相似,在α-碳链上都含有分支脂肪烃链的中性氨基酸,包括亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸;是动物体内不能自主合成的必需氨基酸,在调节动物糖脂代谢、蛋白质代谢和氧化供能等方面发挥重要作用。研究发现BCAA具有提高日增重和饲料报酬、降低体脂率和改善生产性能等作用。且有报道指出BCAA可以影响脂质代谢相关基因的m RNA N~6-甲基腺嘌呤（m~6A）水平,但BCAA对脂质沉积的影响及机制尚不清楚。m~6A是一种真核细胞中最常见的RNA甲基化修饰,调控脂肪沉积、肿瘤发生等多种生物过程。因此,我们提出假设:BCAA是否通过m~6A调节脂肪沉积。本研究以小鼠为动物模型,以3T3-L1前体脂肪细胞系为细胞模型,探究了BCAA对脂肪沉积的影响;进一步从m RNA m~6A的角度进行了机制探讨,为BCAA在畜牧生产中的应用奠定了理论基础。主要研究结果如下:1 BCAA对小鼠脂肪沉积及代谢的影响将4周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠分为2组,每组11只。HF组:高脂饲喂,HF+BCAA组:高脂饲喂和饮水中添加5%BCAA。饲养10周,结果显示HF+BCAA组小鼠的摄食与饮水与HF组小鼠相比,无显著差异（P>0.05）。与HF组相比,HF+BCAA组小鼠体重显著减轻（P<0.05）,脂肪沉积显著减少（P<0.05）,腹股沟皮下白色脂肪的重量减轻了约50%,附睾白色脂肪的重量降低了约65%。与HF相比,BCAA显著降低了小鼠空腹血糖（P<0.05）,显著改善了小鼠葡萄糖耐受性（P<0.05）,增强了胰岛素敏感性（P<0.05）。以上结果表明,BCAA抑制小鼠的脂肪沉积,改善机体糖代谢。2 BCAA对脂肪细胞分化聚酯的影响本研究中使用不同浓度BCAA（0、10、20、30、40 m M）处理3T3-L1细胞,结果显示BCAA以剂量依赖的方式抑制脂肪细胞分化聚酯,显著降低脂肪细胞分化标志基因,过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的表达水平（P<0.05）。与对照组相比,BCAA显著提高了小鼠白色脂肪组织和3T3-L1细胞m RNA m~6A水平,降低了脂肪与肥胖相关蛋白（FTO）表达。在BCAA组细胞中过表达FTO（OE-FTO）回补FTO表达,部分恢复了BCAA组细胞的脂质沉积。以上结果表明,BCAA通过降低FTO表达,提高m RNA m~6A水平,抑制脂肪细胞分化聚酯。3 BCAA抑制脂肪沉积的机制研究（1）BCAA抑制脂肪细胞克隆增殖过程。为了探究BCAA抑制脂肪沉积的机制,我们首先检测了BCAA对前体脂肪细胞分化过程不同阶段的影响。分别在D0-D2,D0-D4,D2-D4阶段处理用30 m M BCAA处理3T3-L1细胞。结果显示BCAA在D0-D2阶段比在D2-D4阶段对脂肪沉积的抑制效果更好。在此阶段主要的生物学事件是:前体脂肪细胞进行克隆增殖。因此,进一步利用流式细胞技术分析了BCAA对细胞克隆增殖阶段细胞周期的影响,结果显示BCAA组中G0-G1期细胞的相对数量以剂量依赖的方式增加,表明BCAA阻滞细胞周期进程。RT-q PCR和Western Blot检测结果显示,BCCA显著抑制了两种重要的MCE调节因子,周期素A2（CCNA2）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）表达。以上结果表明,BCAA通过抑制CCNA2和CDK2的表达,阻滞细胞周期进程,从而抑制脂肪沉积。（2）BCAA通过调节FTO表达,以m~6A依赖的方式抑制CCNA2和CDK2表达。先前的研究表明,BCAA能够影响脂质代谢基因的m~6A水平,进而调控脂质代谢。因此我们提出假设,BCAA是否以m~6A依赖的途径影响CCNA2和CDK2的表达。研究结果显示,BCAA提高了CDK2和CCNA2 m RNA中m~6A的富集水平（P<0.05）,加快了CDK2和CCNA2 m RNA的降解（P<0.05）。考虑到YTH结构域家族蛋白2（YTHDF2）,m~6A结合蛋白之一,可识别含有m~6A修饰的m RNA并加速其降解,本研究利用si YTHDF2抑制YTHDF2的蛋白表达,发现si YTHDF2显著升高了CCNA2和CDK2的m RNA表达水平（P<0.05）。值得注意的是,在BCAA诱导的细胞中,抑制YTHDF2恢复了CDK2和CCNA2 m RNA的正常表达,同时部分恢复了细胞的脂质沉积。这些表明BCAA可升高CCNA2和CDK2 m RNA m~6A水平,在YTHDF2的介导下抑制CCNA2和CDK2的表达。由于前文中发现BCAA通过抑制m~6A去甲基化酶FTO的表达来抑制脂肪沉积,我们推测:BCAA通过调节FTO表达,以m~6A依赖的方式抑制CCNA2和CDK2。研究结果表明,在3T3-L1细胞中抑制内源性FTO表达后,CCNA2和CDK2 m RNA与蛋白表达水平明显下降（P<0.05）。过表达FTO的细胞中CCNA2和CDK2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。此外,抑制YTHDF2部分恢复了si FTO组细胞中CDK2和CCNA2 m RNA表达。以上说明,BCAA抑制FTO表达,升高CCNA2和CDK2 m RNA m~6A水平,在YTHDF2的介导下抑制CCNA2和CDK2的表达。（3）BCAA通过调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）代谢,抑制FTO表达。为了进一步探究BCAA调控FTO表达的机制,本研究检测了BCAA对3T3-L1细胞、白色脂肪组织和血清中NADPH水平的影响。结果显示,BCAA显著降低3T3-L1细胞、白色脂肪组织和血清中NADPH含量（P<0.05）,降低白色脂肪组织中NADPH/NADP+比值（P<0.05）。为了进一步确认NADPH介导了BCAA对FTO的抑制作用,在BCAA处理的3T3-L1细胞中添加NADPH。结果显示,BCAA导致的FTO表达的下降得到有效回补、BCAA导致的m~6A水平的升高被有效抑制（P<0.05）。这些结果表明,BCAA通过NADPH调控FTO蛋白表达和m~6A水平。为了进一步探讨BCAA降低NADPH水平的机制,我们检测了NADPH调控蛋白,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和NAD激酶（NADK）,表达。在3T3-L1细胞和WAT中,BCAA显著抑制G6PD表达。利用G6PD激活剂KCL进行回补试验,结果显示BCAA处理的3T3-L1细胞中NADPH水平得到有效回升,FTO m RNA的表达显著得增加,m RNA m~6A水平显著降低。上述结果表明,BCAA通过抑制G6PD表达,降低NADPH水平来抑制FTO表达。综上所述,BCAA通过降低G6PD表达,抑制NADPH水平,进而下调FTO表达,提高了CCNA2和CDK2的m~6A水平,在YTHDF2蛋白的介导下抑制CCNA2和CDK2的表达,阻滞克隆增殖阶段细胞周期进程,从而抑制脂肪细胞分化聚酯。