大肠杆菌对编码同一种氨基酸的各个密码子的使用频率并不相同,其中,那些不被经常使用的密码子称为稀有密码子。稀有密码子的存在会降低大肠杆菌的翻译水平,这是因为稀有密码子对应的t RNA丰度低。为了提高异源蛋白质的表达,本实验将大肠杆菌BL21（DE3）稀有密码子对应的t RNA基因插入核糖体操纵子,构建能够动态协调t RNA与氨基酸数量的菌株E.coli BL21（DE3）-rrn D::6t RNA,该菌株表达的异源蛋白质Cbi A是E.coli BL21（DE3）表达量的1.49倍,这为工业上克服大肠杆菌密码子偏好性,高效表达异源蛋白质奠定基础。本实验方法是pCas/pTargetF系统,质粒pCas上含有lambda-Red同源重组相关的Exo、Beta、Gam蛋白和Cas9蛋白,发挥切割DNA双链和同源重组的作用;质粒pTargetF上插入N20序列,发挥引导Cas9蛋白切割DNA双链的作用。将大肠杆菌BL21（DE3）稀有密码子对应的6个t RNA基因设计为一个基因片段,送生物公司合成后含有一个碱基突变,采用SOE-PCR方法修复该突变,连接与目的插入位点碱基互补的同源臂,构建打靶片段。质粒pTargetF-N20由Gibson方法构建。打靶片段和质粒pTargetF-N20共转化E.coli BL21（DE3）-pCas菌株感受态,菌落PCR筛选阳性克隆菌株,得到的阳性克隆菌株提取基因组进行测序,结果与预测一致,说明成功构建了E.coli BL21（DE3）-rrn D::6t RNA菌株,IPTG诱导去除质粒pTargetF,37℃培养去除温敏型质粒pCas。测量生长曲线,本实验构建的E.coli BL21（DE3）-rrn D::6t RNA菌株生长曲线与E.coli BL21（DE3）基本重合,说明增加6个t RNA基因没有破坏大肠杆菌细胞内环境的稳定。同样采用Gibson方法构建质粒pet28a-Cbi A,转化菌株E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）-rrn D::6t RNA。探索诱导异源蛋白质Cbi A表达的最佳条件,确定37℃培养,IPTG终浓度为0.1 m M,诱导时间为4 h时表达量最佳。利用SDS-PAGE和Western-Blot定量检测异源蛋白质Cbi A的表达差异,E.coli BL21（DE3）-rrn D::6t RNA菌株表达的异源蛋白质Cbi A是E.coli BL21（DE3）表达量的1.49倍。