目的：　　本研究将利用大鼠胶质瘤细胞系RG-2，首先设计特定的与临床极其相似的大鼠恶性胶质瘤原位移植模型以便于评估腰穿给药白藜芦醇在体内的治疗效果。随后建立大鼠恶性胶质瘤术后模型结合腰穿给药评估白藜芦醇辅助治疗的效果。从体内研究方面对白藜芦醇作为胶质瘤化疗药物的有效性及安全性进行充分论证，以期为白藜芦醇在胶质瘤临床治疗中的应用奠定科学而坚实的基础。　　具体研究内容包括:　　(1)体外培养大鼠胶质瘤细胞系RG-2，通过脑定位仪原位移植构建特定的大鼠恶性胶质瘤原位移植模型，通过间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇(Res)治疗大鼠模型。在治疗后，利用核磁共振(MRI)和对生存时间的统计学分析来评估体内腰椎穿刺白藜芦醇的治疗效果。　　(2)并利用多种实验手段及技术、从分子层面针对白藜芦醇抗胶质瘤作用在大鼠模型中的可靠性进行检测并对其内在抗肿瘤分子机制进行探讨。　　(3)在成功构建大鼠恶性胶质瘤原位移植模型的基础上，在模型大鼠发病后利用手术开窗的方法部分切除肿瘤来构建术后大鼠模型。　　(4)再通过间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇治疗术后大鼠模型。在治疗后，利用病理切片测算肿瘤面积和对生存时间的统计学分析来评估体内腰椎穿刺白藜芦醇的治疗效果，并利用多种实验手段及技术、从分子层面针对白藜芦醇抗胶质瘤作用在大鼠模型中的可靠性进行检测并对其内在抗肿瘤分子机制进行探讨。　　方法：　　本实验所用的大鼠恶性胶质母细胞瘤细胞系RG-2由瑞士洛桑大学医学院(Centre Hospitalier Universitaire Vaudois，CHUV)神经外科实验室提供，本实验室传代保存。实验所用的SD大鼠由大连医科大学实验动物中心提供。所有的胶质瘤细胞系都是培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中。首先通过体外培养胶质瘤细胞系RG-2，当细胞密度达到对数期时收集细胞，利用脑定位仪将收集的细胞移植进大鼠脑内，建立大鼠恶性胶质瘤原位移植模型;再行核磁共振(MRI)和造影剂增强成像监测胶质瘤细胞着床成瘤时间，从而实现早期诊断以确定白藜芦醇的干预时间。细胞移植成功后，将所有大鼠随机分成2组，每组各12只，肿瘤移植三天后，处理组:间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇300μmol/L(生理盐水溶)，10-4μmol/g，对照组:间歇性腰椎穿刺注射等比例的含有0.3％ DMSO的生理盐水，每3天一次，至死亡，统计生存时间和MRI检测的肿瘤面积，进行统计学分析。对收集的鼠脑样本石蜡脱水包埋后组织切片，采用HE染色分析对比治疗后大鼠脑部肿瘤细胞的病理形态学变化，免疫组织化学(IHC)分析给药后肿瘤增殖活性(Cyclin D1)的变化，TUNEL染色分析给药后肿瘤细胞的凋亡情况，验证大鼠恶性胶质瘤原位移植模型经过间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇治疗后，治疗效果的真实性和可靠性。利用高效色谱液相(HPLC)，检测间歇性腰椎穿刺注射后白藜芦醇在大鼠脑中及肿瘤的分布特点。通过Western—blotting、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光染色(IF)等方法从分子水平对白藜芦醇抗胶质瘤作用的内在分子机制(STAT3信号通路）和自噬现象（LC3和Beclin1）进行阐明和探讨。随后，在原有大鼠恶性胶质瘤原位移植模型的基础上，待大鼠出现发病特征后（如行动能力下降，颅压升高，眼鼻粘膜出血等），利用手术开窗的方法部分切除肿瘤来构建术后大鼠模型。手术成功后，将所有大鼠随机分成2组，每组各14只。手术成功24小时后，处理组:间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇300μmol/L(生理盐水溶)，10-4μmol/g，每3天一次，共给药18天;对照组:术后只观察不做任何处理，记录生存时间并进行统计学分析。在治疗后，利用病理切片测算肿瘤面积对比手术切除肿瘤的面积和体内腰椎穿刺白藜芦醇的治疗效果。并利用免疫组织化学(IHC)分析给药后肿瘤增殖活性（Ki-67）的变化，TUNEL染色和透射电镜分析给药后肿瘤细胞的凋亡情况，验证大鼠术后模型经过间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇治疗后，治疗效果的真实性和可靠性。通过Western—blotting、免疫组织化学(IHC)等方法从分子水平对白藜芦醇抗胶质瘤作用的内在分子机制(STAT3信号通路)再次进行验证。　　结果：　　一、白藜芦醇腰穿给药治疗对大鼠脑胶质母细胞瘤生长的抑制作用　　1.RG-2细胞在SD大鼠脑中原位移植可稳定成瘤　　2.间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇可有效抑制肿瘤生长延长模型大鼠的生存时间　　3.白藜芦醇可在体内诱导肿瘤细胞坏死　　4.白藜芦醇可在体内抑制胶质瘤细胞的增殖活性并诱导其发生凋亡　　二、白藜芦醇腰穿给药治疗对大鼠脑内胶质母细胞瘤的STAT3信号通路抑制作用　　1.白藜芦醇可在体内诱导肿瘤细胞坏死且腰椎穿刺可以有效地使白藜芦醇到达肿瘤组织和瘤周组织　　2.白藜芦醇可在体内有效抑制胶质瘤细胞中STAT3信号转导通路的活化并产生自噬反应　　三、大鼠原位胶质母细胞移植瘤部分切除术及疗效分析　　1.利用手术开窗部分切除肿瘤的方法构建术后模型稳定可靠　　四、白藜芦醇术后腰穿给药治疗明显改善大鼠脑胶质母细胞的预后　　1.手术后辅助腰椎穿刺注射白藜芦醇可有效抑制肿瘤生长延长术后模型大鼠的生存时间并使部分大鼠获得治愈　　统计学分析:治疗组的大鼠生存时间长于对照组的大鼠，生存时间得到延长，对照组平均生存时间为7.3±1.3天，术后腰穿治疗组中9只未治愈大鼠的平均生存时间为11.0±2.9天，另外5只大鼠成功治愈(5/14;35.7％);t检验分析结果为治疗组与对照组的P值小于0.05，说明存在统计学差异，两组生存时间有差异性。生存寿命图也证明，治疗组大鼠的生存率和生存时间明显优于对照组。Adobe Photoshop CS4测算死亡大鼠肿瘤面积显示:治疗组肿瘤平均面积（555.8±84.6 mm2），小于对照组的(906.4±330.1 mm2，p＜0.05)。　　2.白藜芦醇可在体内诱导肿瘤细胞坏死，抑制肿瘤复发　　肿瘤组织石蜡脱水包埋后组织切片，HE染色和病理学观察分析结果证明，对照组的肿瘤组织结构完整，肿瘤细胞生长旺盛，密集成簇，肿瘤组织周边呈侵袭性生长;治疗组的移植瘤内可见大量肿瘤细胞死亡并形成液化坏死灶，且以血管周边为甚，肿瘤组织周边比较规整，未见明显的侵袭性生长。治愈大鼠的大脑经过10％福尔马林固定后显示，大鼠脑中未见明显的肿瘤块，原肿瘤移植区仅仅残留下一个液化的空腔。　　3.白藜芦醇可在体内抑制胶质瘤细胞的增殖活性并诱导其发生凋亡免疫组织化学(IHC)分析表明对照组的肿瘤细胞增殖活性较强(Ki-67表达呈阳性），治疗组的肿瘤细胞的Ki-67阳性表达明显减弱。TUNEL结果显示:对照组肿瘤组织区域，仅可见少量单个细胞呈阳性反应，治疗组的肿瘤组织区域中发现大量密集阳性反应细胞。透射电镜结果表明，对照组中肿瘤组织在电镜下无超微结构改变，在治疗组肿瘤组织中，大量死亡细胞出现细胞皱缩，核膜周围染色质凝聚，在治愈大鼠的液化空腔内可见含有大量线粒体的神经细胞突触，而不是胶质瘤细胞。　　4.白藜芦醇可在体内有效抑制胶质瘤细胞中STAT3信号转导通路的活化并上调其上游抑制分子　　免疫组织化学(IHC)分析表明，未经过腰椎注射白藜芦醇的对照组的肿瘤细胞存在STAT3的表达，而治疗组的肿瘤细胞STAT3的表达水平明显下降。而STAT3的磷酸化(p-STAT3)情况为，对照组中p-STAT3的阳性染色主要位于胶质瘤细胞的细胞核中，经过的对照组胶质瘤细胞核中的阳性染色明显减弱。与之相反，STAT3的抑制因子PIAS3在治疗组肿瘤细胞中的表达水平明显上调，而在对照组肿瘤细胞中的表达一直维持在较低水平。Western blotting灰度分析的结果表明，术后辅助腰椎注射白藜芦醇治疗模型大鼠可引起脑中肿瘤组织中STAT3和p-STAT3的表达水平明显下降，而PIAS3的表达水平则明显升高。　　结论：　　一、RG-2细胞构建的大鼠恶性胶质瘤原位移植模型稳定可靠，间歇性腰椎穿刺注射白藜芦醇治疗可有效抑制体内肿瘤的生长并延长模型大鼠的生存时间。　　二、腰椎穿刺给药方式可以使白藜芦醇有效地到达肿瘤组织和瘤周组织并在体内诱导肿瘤细胞坏死。　　三、腰椎穿刺白藜芦醇可在体内抑制胶质瘤细胞的增殖活性，诱导其发生凋亡并增强自噬能力。　　四、白藜芦醇可在体内有效抑制胶质瘤细胞中STAT3信号转导通路的活化。　　五、在原有大鼠恶性胶质瘤原位移植模型的基础上，利用手术开窗部分切除肿瘤方法构建的术后模型稳定可靠。　　六、手术后辅助腰椎穿刺注射白藜芦醇可有效抑制肿瘤生长延长术后模型大鼠的生存时间并使部分大鼠获得治愈。　　七、手术后辅助腰椎穿刺注射白藜芦醇可在体内诱导肿瘤细胞坏死，抑制肿瘤复发并抑制胶质瘤细胞的增殖活性，诱导其发生凋亡。　　八、手术后辅助腰椎穿刺注射白藜芦醇可在体内有效抑制胶质瘤细胞中STAT3信号转导通路的活化并上调其上游抑制分子。