论文部分内容阅读
背景疟疾是流行范围较大,威胁全球,严重影响人类健康与发展的一类重大传染性疾病。疟原虫尤其是恶性疟原虫对抗疟药耐药性的问题日益严重,加上全球气候变暖,蚊媒分布区域扩大,使疟疾成为阻碍疟疾流行区国家、社会与经济发展的重要问题。亚非疟区低海拔、高温、潮湿的环境与疟疾的发病、发展及预后转归紧密联系,中医学中疟疾的发病也与感染湿热邪气密切相关。辨证论治是中医学体系的核心,结合中医证型建立病证结合的疟疾动物模型,能够为研究与开发利用中医药预防和治疗疟疾提供实验室基础。合理用药对于延缓恶性疟原虫耐药性的产生具有极其重要的意义。观察湿热因素对疟原虫生长规律与青蒿素和哌喹耐药性的影响,可以为指导非洲湿热环境疟区的预防与治疗提供实验室依据。目的本研究在中医基础理论的指导下,综合利用饮食、环境及疟原虫感染的多因素方法模拟建立病证结合的鼠疟湿热证模型；分析湿热因素对感染伯氏疟原虫K173株小鼠原虫增长的影响,掌握不同环境下感染小鼠体内疟原虫生长规律的变化；在鼠疟湿热证模型上培育出具有一定抗性指数的青蒿素与哌喹的抗性株,观察鼠疟湿热证模型是否会影响伯氏疟原虫K173株对青蒿素和哌喹抗药性的产生。方法1采用高糖高脂饮食加湿热外环境的实验方法对昆明小鼠进行干扰,探索模型建立所需的温度条件；给予高糖高脂饮食,并置于高温高湿环境下一定时间后,腹腔接种伯氏疟原虫K173株(P.b.K173)感染昆明小鼠,建立病证结合的鼠疟湿热证模型,观察研究模型小鼠体重、肛温和摄食饮水量的变化,精神、活动、皮毛和大小便情况以及血清水通道蛋白4(AQP-4)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)的水平,对鼠疟湿热证模型进行初步评价。2观察比较正常环境,湿热环境和湿热证小鼠在感染P.b.K173后疟原虫感染率变化,采用酶联免疫方法(ELISA法)检测各组小鼠血清干扰素γ(IFN—γ)、白细胞介素4(IL-4)水平及其比值的变化。3采用药物剂量递增法进行抗性培育,直到培育出有一定抗性程度的青蒿素和哌喹抗性虫株。在鼠疟湿热证模型上进行P.b.K173青蒿素和哌喹的抗性培育,与正常环境下抗性培育同时进行,每隔5代用Peters4天抑制实验检测ED90并计算获得抗性指数I90,观察比较P.b.K173在不同条件下抗性指数的变化,分析鼠疟湿热证模型对P.b.K173青蒿素及哌喹耐药性产生的影响。结果1本实验采取高糖高脂饮食加湿热外环境13天的造模方法,在未感染疟原虫之前小鼠可见大便粘,小便黄,肛温较高。接种P.b.K173后,小鼠体温持续升高。造模结束后,模型小鼠出现体重减轻,肛温升高,饮水量减少以及精神倦怠萎靡、活动减少、皮毛无光泽、大便粘、小便黄、肛门红肿的异常症状,符合小鼠湿热证候辩证标准,并与临床上湿热证候症状及体征接近。模型组小鼠血清AQP-4及TNF-α水平为3.15±0.33ng/mL,706.66±84.59pg/mL均高于正常小鼠2.46±0.12ng/mL,313.51±43.08pg/mL,其中TNF-α水平模型组比大肠杆菌湿热证小鼠537.23±34.78pg/mL要高,差异均有统计学意义(P<0.05),鼠疟湿热证小鼠机体内免疫反应强烈。2观察发现湿热证和湿热环境下小鼠的原虫感染率在感染早期较正常环境小鼠要低。对比正常环境,湿热证以及湿热环境三组小鼠血清IFN-γ、血清IL-4、腹腔巨噬细胞吞噬率及N0水平的变化发现,各指标水平均出现早期上升后期下降的现象。各组小鼠血清IFN-γ水平在感染后第4天达到峰值,分别为1091.51±73.60pg/mL,1186.02±41.14 pg/mL,1112.77±43.23 pg/mL。IL-4水平在感染后第6天达到峰值,分别为337.31±16.88 pg/mL,333.32±18.63 pg/mL,347.51±26.60 pg/mL。湿热证小鼠和湿热环境小鼠在感染早期血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值比正常环境小鼠要高,差异有统计学意义(P<0.05)。IFN-γ因子可能激活并增强巨噬细胞吞噬功能抑制疟原虫生长,但后期IFN-γ、IL-4因子大量减少,巨噬细胞吞噬活性降低,原虫感染率爆发性增长,最终导致小鼠死亡。3历时六个月的1至20代抗性培育发现,培育至20代,常态组和湿热证组青蒿素抗性株抗性指数I90分别为5.8,2.7,青蒿素3天给药剂量由185.88mg/kg增至478.67mg/kg,293.10mg/kg,表现为轻度抗性。常态组和湿热证组哌喹抗性株抗性指数I90分别为10.9,5.2,常态组哌喹虫株表现出中度抗性,而湿热证组仍为轻度抗性。说明湿热证在一定程度上减缓了P.b.K173对青蒿素及哌喹抗药性的产生。结论1采用高糖高脂饮食、湿热外环境及感染伯氏疟原虫K173株的多因素叠加造模方法成功建立了病证结合的鼠疟湿热证动物模型。2 P.b.K173感染昆明小鼠后早期发生以IFN-γ表达升高为主的Thl(辅助性T细胞1型)介导的免疫反应,鼠疟湿热证小鼠在感染疟原虫后早期原虫生长受到抑制,与高水平IFN-γ表达增强巨噬细胞功能有关。3目前的抗性培育结果表明,湿热证对P.b.K173青蒿素及哌喹抗药性的产生有一定影响。