如何使由于创伤、炎症、肿瘤等疾病而造成的颌面骨大范围缺损获得完全性恢复,一直是国内外临床追求的目标和着力研究的热点课题。从发育生物学的角度,要达到骨组织结构与功能的完全恢复,需要充足的干细胞在适宜的微环境下形成大量的细胞外基质并成熟钙化。目前只有自体骨移植能达到功能上的恢复,仍是骨移植治疗的金标准。但是由于导致供区二次创伤,临床大面积应用受到限制。利用骨组织工程发展新型骨移植替代物为克服当前困境提供了一个充满希望的途径。传统的骨组织工程是利用大量的细胞种植在支架材料上,通过支架材料或活性因子等诱导种子细胞分化成骨、钙化。研究发现细胞体外种植在支架上与体内特性存在明显的区别,而且多孔支架的内部细胞的营养供应和废物排泄等单纯依靠外周的渗透代谢方式局限性明显。细胞膜片组织工程因含有自身分泌的细胞外基质,保留了相关蛋白和生物活性因子,为体内骨创的完美愈合修复提供了适宜的微环境。但单纯细胞膜片不适合构建相对细胞稀疏、基质丰富的骨组织。骨再生修复与正常骨发育的相似性提示我们,可通过部分模拟骨发育的进程从而获得骨组织的完全修复再生。生骨细胞膜片理论上能够为骨髓间充质干细胞提供类似发育期的微环境,片状支架材料理论上能够为骨修复提供模板和必要的无机物,膜片和片状材料的复合体模拟骨膜和骨,理论上能够成为骨修复层次的基本单位。因此,本研究拟建立发育期骨髓间充质干细胞膜片的培养、收获、移植操作程序,利用人工配制的骨诱导液,促进骨髓间充质干细胞膜片的成熟、钙化,并在此基础上首次尝试利用细胞膜片和片状珊瑚支架材料构建骨修复单位,体内异位构建骨组织和原位修复极限骨缺损,以期为叠加构建组织工程化骨组织的临床应用探寻一条可行的研究途径。所获得的主要研究结果如下:1、骨髓间充质干细胞膜片诱导分化体外研究为了验证骨髓间充质干细胞膜片与片状珊瑚材料是否适合成骨,本实验建立了间充质干细胞与材料的共培养体系,观察了间充质干细胞的多向分化潜能,细胞膜片与片状珊瑚材料的成骨诱导后一段时间内的成骨相关基因的表达变化。结果显示:珊瑚材料的浸提液和正常培养液中细胞的生长曲线没有明显差异,经过诱导的细胞膜片/片状珊瑚材料复合体能够有效的向成骨细胞谱系分化,并在诱导的早期表达生骨和生血管相关基因。本研究的结果充分说明,体外诱导培养的细胞膜片成熟程度较高,这点对早期血管化,运送氧气和养料到内部的种子细胞尤为重要。尤其是体内成骨过程,细胞膜片因含有大量细胞基质,细胞间交流信号更加快速有效。因此体外检测结果显示我们所设想的在骨组织工程中以骨髓间充质干细胞膜片为植入方式,利用骨组织的发育学的机理来指导片状复合结构叠加构建的策略是初步可行的。2、细胞膜片/片状珊瑚材料复合体的构建及应用于体内的研究本研究在充分借鉴细胞膜片技术的基础上,提出了一种全新的片状结构复合叠加构建骨组织的结构策略:先构建细胞-基质膜片;而后利用细胞膜片可贴附表面的特性建立适宜的多层细胞膜片复合体三维立体体系;最后与预制成型的珊瑚支架材料复合叠加,构建包含类似骨膜骨片复合体结构的骨修复单位层次结构。为验证设想的可操作性,利用包含抗坏血酸的α-MEM培养基,体外扩增培养的骨髓间充质干细胞分泌基质形成内源性支架与片状珊瑚材料外支架,形成了具备一定强度和可操作性的复合结构。将复合结构进行体内移植显示:异位成骨的条件下,成骨诱导条件培养液诱导后的单纯骨髓间充质干细胞膜片移植6周后未见骨样结构;经过成骨诱导培养液诱导的细胞和细胞膜片与片状珊瑚支架材料重组后都形成了类似骨样的结构。原位成骨的条件下,单纯珊瑚支架组可见骨创边缘少量新骨形成;而经过成骨诱导的骨髓间充质干细胞种植在片状珊瑚支架材料组形成了编织骨样的结构;经过成骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片与片状珊瑚支架材料重组后形成了板层骨样的结构。本研究说明,骨髓间充质干细胞膜片能充分利用细胞自身分泌的生物活性因子和细胞外基质建立局部微环境,与片状珊瑚外支架材料复合后能部分模拟初始成骨作用。体内异位实验虽然只构建两个膜片支架复合体成骨,原位成骨未能按照预期设计最终构建出与周围骨创完美修复的骨样结构,但却初步验证了我们的策略有一定的可行性,继续对其进行改进、完善将是我们今后的研究重点。总之,本研究的结果显示细胞膜片构建组织工程骨具有一定的优势,因此本研究对利用骨髓间充质干细胞诱导的生骨细胞膜片构建和发展有临床意义的三维骨组织工程结构具有一定的益处。