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研究背景癫痫是神经内科的常见疾患之一,其病因复杂,发病机制尚未明确。近年来关于癫痫遗传学机制的研究迅速增加,为推动癫痫精准治疗提供了新靶点。ARHGEF15基因位于人类17号染色体,其编码的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子15,又称Ephexin5,具有鸟嘌呤核苷酸交换活性,可以调控Rho GTP酶由失活型向活性型转换,使Rho GTP酶在细胞信号转导通路中发挥分子开关作用。一项关于rolandic癫痫危险因素的CNV研究发现鸟嘌呤交换因子激活通路的显著富集,有研究者在癫痫性脑病患儿中发现了ARHGEF15基因的新生突变。另外,在临床工作中,对癫痫患者进行全外显子测序,也发现了ARHGEF15基因的错义突变。虽然多种证据指向ARHGEF15基因功能可能与癫痫相关,然而其在癫痫的发生发展中究竟扮演何种角色尚不清楚。在神经系统,Ephexin5可以通过激活RhoA发挥作用,ROCK是RhoA下游信号分子,其中ROCK2主要分布于神经组织。有研究表明,癫痫小鼠神经元中ROCK2和p-ROCK2表达增加,ROCK通路激活后能够调节下游炎症因子产生,而炎症反应可以促进癫痫的发生。本实验通过研究ARHGEF15基因敲除及人源ARHGEF15基因条件性过表达对小鼠癫痫易感性的影响,探究ARHGEF15基因是否参与癫痫发病及可能机制,为癫痫病因学研究提供新思路。研究目的完成ARHGEF15基因敲除小鼠的构建,并对其杂合型纯化繁殖,得到ARHGEF15基因敲除纯合型小鼠(E5-/-)及作为对照的野生型小鼠(WT)。完成人源ARHGEF15基因条件性过表达小鼠的构建,对其杂合型纯化繁殖,并与Cre工具鼠互配,得到Cre阳性仅神经系统过表达人源ARHGEF15基因纯合型小鼠(E5CKI/CKI·Cre+)及作为对照的未敲入人源ARHGEF15基因的Cre阳性小鼠(E5W-T/W T·Cre+)。对不同基因型小鼠的癫痫易感性、RhoA-ROCK2通路的表达水平进行分析,探讨ARHGEF15基因敲除及人源ARHGEF15基因条件性过表达对小鼠癫痫易感性的影响及对RhoA-ROCK2通路的影响,进一步了解癫痫的发病机制,为癫痫治疗提供新的靶点。研究方法进行ARHGEF15基因敲除杂合型C57BL/6J小鼠(E5+/-)的构建;繁育产生野生型(WT)、ARHGEF15基因敲除杂合型(E5+/-)、ARHGEF15基因敲除纯合型(E5-/-)这3种不同基因型的小鼠;其中WT小鼠及E5-/-小鼠用于实验,E5+/-小鼠用于繁育后代。进行人源ARHGEF15基因条件性过表达杂合型C57小鼠(E5CKI/WT)的构建;繁育得到野生型(E5WT/WT)、人源ARHGEF15基因条件性过表达杂合型(E5CKI/WT)和人源ARHGEF15基因条件性过表达纯和型(E5CKI/CKI)这3种不同基因型的小鼠;E5CKI/CKI小鼠与Cre工具鼠互配,得到Cre阳性仅神经系统过表达人源ARHGEF15基因杂合型小鼠(E5CKI/WT·Cre+);E5CKI/W T·Cre+小鼠自交得到Cre阳性仅神经系统过表达人源ARHGEF15基因纯合型小鼠(E5CKI/CKI·Cre+)和用于对照的未敲入人源ARHGEF15基因的Cre阳性小鼠(E5WT/WT·Cre+)。采用1只雄鼠与1-3只雌鼠的合笼比例繁育小鼠,子代小鼠剪指甲提取DNA进行聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型。以8-10周龄的WT小鼠、E5-/-小鼠、E5WT/W T·Cre+小鼠和E5CKI/CKI·Cre+小鼠为研究对象,每组各12只,应用腹腔注射戊四氮(PTZ)60mg/kg构建癫痫发作模型,依照改良Racine行为学分级标准对小鼠癫痫发作情况进行评估,根据监控视频记录每只小鼠药物注射半小时内“癫痫发作的最高级别”、“级别分类-轻度/重度”、“是否有强直阵挛”、“从注射药物到首次强直阵挛发作的潜伏期”、“强直阵挛次数”、“强直阵挛持续总时长”及“是否死亡”7项指标。应用Western blot检测各基因型小鼠大脑Ephexin5表达水平,检测WT小鼠和E5-/-小鼠海马组织中RhoA、p-RhoA、ROCK2 和 p-ROCK2 表达水平。本实验数据采用 IBM SPSS Statistics 25统计软件进行分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1、成功构建了ARHGEF15基因敲除杂合型小鼠,并得到了野生型(WT)、ARHGEF15基因敲除杂合型(E5+/-)、ARHGEF15基因敲除纯合型(E5-/-)这3种不同基因型的小鼠。2、成功构建了人源ARHGEF15基因条件性过表达杂合型小鼠,并得到了野生型(E5WT/WT)、人源ARHGEF15基因条件性过表达杂合型(E5CKI/WT)、人源ARHGEF15基因条件性过表达纯和型(E5CKI/CKI)、未敲入人源ARHGEF15基因的Cre阳性小鼠(E5WT/W T·Cre+)、Cre阳性仅神经系统过表达人源ARHGEF15基因杂合型小鼠(E5GKI/WT·Cre+)、Cre阳性仅神经系统过表达人源ARHGEF15基因纯合型小鼠(E5CKI/CKI·Cre+)这6种不同基因型的小鼠。3、癫痫发作行为学实验结果:与野生型小鼠(WT)相比,ARHGEF15基因敲除纯合型小鼠(E5-/-)注射戊四氮(PTZ)后半小时内的“强直阵挛持续总时长”明显下降(P<0.05),而对于“癫痫发作的最高级别”、“级别分类-轻度/重度”、“是否有强直阵挛”、“从注射药物到首次强直阵挛发作的潜伏期”、“强直阵挛次数”及“是否死亡”这6项指标,E5-/-小鼠与WT小鼠差异无统计学意义(P>0.05)。Cre阳性仅神经系统过表达人源ARHGEF15基因纯合型小鼠(E5CKI/CKI·Cre+)与未敲入人源ARHGEF15基因的Cre阳性小鼠(E5WT/WT·Cre+)相比,注射戊四氮(PTZ)后半小时内“癫痫发作的最高级别”、“级别分类-轻度/重度”、“是否有强直阵挛”、“从注射药物到首次强直阵挛发作的潜伏期”、“强直阵挛次数”、“强直阵挛持续总时长”及“是否死亡”7项指标均无显著差异(P>0.05)。4、Ephexin5、RhoA-ROCK2通路表达水平:8-10周龄的ARHGEF15基因敲除纯合型小鼠(E5-/-)与野生型小鼠(WT)相比,海马中RhoA、p-RhoA、ROCK2和p-ROCK2表达水平均未见明显差异(P>0.05),且在这两种基因型的成年小鼠海马中均未见Ephexin5表达;而对于出生2天的WT小鼠可在全脑组织检测到Ephexin5表达,且同龄E5-/-小鼠脑组织几乎检测不到Ephexin5。成年E5CKI/CKI·Cre+小鼠、E5CKI/WT·Cre+小鼠海马可表达人源Ephexin5。研究结论1、ARHGEF15基因敲除可以显著降低戊四氮(PTZ)诱导的成年小鼠癫痫发作的“强直阵挛持续总时长”,而对于“癫痫发作的最高级别”、“级别分类-轻度/重度”、“是否有强直阵挛”、“从注射药物到首次强直阵挛发作的潜伏期”、“强直阵挛次数”及“是否死亡”无显著性影响。2、神经系统过表达人源ARHGEF15基因对戊四氮(PTZ)诱导的成年小鼠癫痫发作行为学无显著影响。3、ARHGEF15基因敲除不影响成年小鼠海马RhoA-ROCK2通路相关分子的表达和激活,可能与成年小鼠海马不表达Ephexin5有关。