研究背景及目的：　　原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）的死亡率排名全球所有癌症的第二位，且发病率近年来有增加的趋势。由于遗传异质性差异大，肝细胞癌的有效治疗手段十分有限，疗效也不确切。因此，积极探索HCC的发生机制及其危险因素是HCC诊断治疗中亟待解决的一个重要问题。近年来越来越多的证据显示，环境中肝毒素的摄入如黄曲霉毒素、微囊藻毒素等与HCC的发病风险密切相关。　　黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）与微囊藻毒素LR（Microcystins LR, MC-LR）是自然界中广泛存在的生物毒素，具潜在的致癌风险，已成为我国面临的主要环境问题之一。我们前期研究发现，中国西南地区人群常同时暴露于两种毒素，并发现两种毒素与当地人群肝脏及肾脏损伤有密切的关系。前期病例对照研究发现，人体血清AFB1与MC-LR 内暴露水平分别与人群 HCC 发病风险呈显著正相关，但分析两者联合效应时，却发现人群 HCC 风险降低，表明两毒素可能存在相互拮抗的作用。两种毒素都以肝脏为靶器官，AFB1是公认的1类人类明确致癌物质，MC-LR为2B类可能致癌物质。AFB1是经典的间接致癌物，需经过体内CYP450酶的活化代谢后才具有致癌作用。因此任何可能影响AFB1活化代谢的因素都将影响其最终的致癌效应。然而，有文献报道AFB1及MC-LR联合暴露能显著促进动物肝脏肿瘤的发生，二者表现为明显的协同效应，这与我们在人群中的发现存在矛盾。很少有研究显示MC-LR可通过影响AFB1关键代谢酶CYP450来影响AFB1的致癌效应。以往的研究大多未考虑两种毒素同时暴露时在机体内的实际效应，两种毒素长期联合暴露的致肝癌效应尚不明确，值得进一步从细胞及动物水平研究其效应及机制。　　Gankyrin 自发现以来引起了研究者们的广泛关注，大量研究均显示 Gankyrin 在多种恶性肿瘤，包括 HCC 中都呈现过度表达状态，被认为是肝癌发生及预后判断的重要标记物。研究发现，Gankyrin 既能特异性结合 Rb，并促进其降解，又能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用，促进p53蛋白的泛素化及降解，两种关键抑癌蛋白的缺失，最终导致肿瘤的发生发展。大量研究证明Gankyrin在促癌过程中参与多条信号通路，对信号分子的调节起着重要的作用，包括Wnt/β-Catenin、NF-κB、STAT3/Akt、IL-1β/IRAK-1、RhoA/ROCK及JNK等，进而对细胞增殖、周期、凋亡及迁移起着重要的作用，诱导肿瘤发生。然而，尽管关于Gankyrin在促进HCC发生中的作用及机制已被广泛研究，大部分研究均仅局限于研究肝急性损伤或仅比较肝癌细胞与正常肝细胞的差异，Gankyrin在生物毒素慢性暴露所致肝癌过程中的作用鲜有报道，AFB1 及 MC-LR 长期慢性暴露诱导肝细胞恶性转化及HCC的发生中的作用及其机制尚不明确。　　研究方法：　　1. AFB1与MC-LR及其联合暴露对肝脏致癌效应研究：　　①采用人正常肝细胞L02，分别用AFB1（1mg/L）、MC-LR（1 μg/L及10 μg/L）单独或二者联合长期染毒，连续染毒并传代至35代；CCK-8法、平板克隆形成实验测定细胞的增殖情况；软琼脂克隆形成实验测定细胞非锚着依赖生长能力；Transwell细胞迁移实验检测细胞的迁移能力；裸鼠荷瘤实验检测细胞的成瘤性；　　②采用AFB1（200 μg/kgbw）、MC-LR（1 μg/kgbw及10 μg/kgbw）单独或二者联合长期腹腔染毒SD大鼠，饲养至染毒后第35周；记录大鼠体重、肝功，肝脏病理H&E染色及透射电镜观察；免疫组化研究肝脏肝癌标记物AFP、GST-p、Survivin、GPC3的表达。　　③RT-qPCR检测两毒素单独及联合染毒组大鼠CYP1A1，CYP1A2，CYP3A4的表达，免疫组化染色检测各组大鼠肝脏AFBO-DNA加合物的表达。　　2. Gankyrin在AFB1长期暴露致肝癌过程中的作用及机制研究：　　①收集临床HCC患者血液及组织标本；ELISA 定量分析血清 AFB1-白蛋白加合物水平，RT-qPCR 及Western Blot检测肝组织Gankyrin转录及蛋白表达水平，分析二者的相关性，H&E染色观察HCC患者肝组织病理，免疫组化观察肝组织Gankyrin表达；　　②1mg/L AFB1长期染毒至第35代的L02细胞，采用质粒转染及siRNA干扰技术过表达或敲低细胞Gankyrin的表达；CCK-8法及平板克隆形成实验检测细胞增殖活性，流式细胞技术检测细胞周期，划痕实验及 Transwell 细胞迁移实验分析细胞迁移能力；裸鼠荷瘤实验分析细胞的成瘤性；DCFH-DA法检测细胞活性氧ROS的含量；RT-qPCR检测细胞β-catenin及其调控因子及下游效应分子cyclin D1、Axin-2、GPR49及REG3A等mRNA的表达水平；　　③利用研究方法1中建立的AFB1染毒大鼠模型，用RT-qPCR、Western Blot及免疫组化分别检测大鼠肝脏组织Gankyrin转录及蛋白表达水平。　　3. Gankyrin在MC-LR长期暴露致肝癌前病变过程中的作用及机制研究：　　①收集临床HCC患者血液及组织标本；ELISA定量分析血清MC-LR水平，RT-qPCR检测肝组织Gankyrin转录水平，分析二者的相关性；　　②不同浓度的MC-LR（0、1、10、100 nM）长期染毒肝L02细胞传代至第35代；siRNA干扰技术敲低细胞Gankyrin的表达；测定细胞增殖活性，平板克隆形成情况，划痕实验测定细胞迁移能力；裸鼠成瘤实验检测细胞成瘤性，免疫组化检测裸鼠肿瘤组织中Gankyrin蛋白表达；RT-qPCR及Western Blot分别检测细胞的Gankyrin mRNA及蛋白表达水平；　　③利用研究方法1中建立的MC-LR （10μg/kg）染毒大鼠模型，用RT-qPCR、Western Blot及免疫组化分别检测大鼠肝脏组织Gankyrin转录及蛋白表达水平。　　研究结果：　　1.低剂量的AFB1（1 mg/L）及MC-LR（1 μg/L及10 μg/L）长期单独染毒均能显著提高肝细胞的增殖活性及细胞迁移能力，改变细胞形态；而AFB1与MC-LR联合染毒，虽能一定程度促进细胞恶性转化，但转化效率显著低于AFB1单独染毒，AFB1的致癌效应被抑制，二者呈现出明显的拮抗效应。AFB1+MC-LR 联合染毒细胞的成瘤能力显著低于单独AFB1染毒细胞，联合染毒组肿瘤生长速度及第28天肿瘤重量显著高于MC-LR单独染毒组（约高3-7倍），但低于AFB1单独染毒组。各染毒组裸鼠肿瘤组织中的AFP阳性率均高于DMSO组。AFB1单独染毒组的阳性细胞最多，显著高于不同剂量单独MC-LR组及联合染毒组。长期AFB1单独染毒及AFB1+MC-LR联合染毒均能导致大鼠肝脏功能损伤，且联合染毒组肝脏损伤程度较 AFB1 单独染毒组大鼠轻。AFB1 单独暴露 SD 大鼠的肝脏损伤最重，且出现肝癌组织，其致癌效应显著强于AFB1+MC-LR联合染毒。随着暴露时间延长，AFB1、A+M1、A+M10组大鼠肝脏组织中肝癌前标志物GST-P阳性细胞区域面积也随之增加，同一染毒时间点，AFB1单独染毒组阳性细胞数、面积稍高于联合染毒组，二者联合染毒无明显的协同效应。机制研究显示，AFB1单独染毒35周能显著提高SD大鼠肝脏CYP1A2及AFBO-DNA加合物表达水平（CYP1A2 mRNA水平与对照组比较约提高39倍，P＜0.05），而AFB1+MC-LR联合染毒组CYP1A2及AFBO-DNA加合物表达水平显著低于单纯AFB1染毒组。　　2.肝组织Gankyrin表达水平与HCC患者AFB1内暴露水平呈正相关（r = 0.342，n= 56，P = 0.010），AFB1高暴露组患者肿瘤组织中的Gankyrin表达水平显著高于低暴露组（P=0.042）。AFB1长期慢性暴露及高表达Gankyrin能显著提高肝细胞的增殖活性（具有明显的时间依赖效应）、增加细胞S期比例、促进细胞迁移能力；而Gankyrin敲低抑制AFB1处理的L02细胞的增殖及迁移，并抑制细胞分裂。Gankyrin敲低抑制AFB1长期染毒细胞的裸鼠成瘤能力（肿瘤重量降低4.9倍，P＜0.05）。AFB1长期暴露促进L02细胞ROS生成（约升高3倍，P＜0.05），显著诱导细胞β-catenin mRNA表达水平的升高（约升高5.7倍，P＜0.05），并促进β-catenin正向调控因子Axin-2及其下游效应分子cyclinD1、GPR49及REG3A的转录水平，而其负向调控因子Glutamine synthase表达却显著降低，而 Gankyrin 表达敲低能产生相反的效应。AFB1 长期暴露可诱导 SD 大鼠 HCC的发生（发生率14.29％），AFB1长期染毒大鼠肝脏HCC标志物GST-p、AFP、survivin及GPC3的表达水平均显著升高，RT-qPCR、Western Blot及免疫组化染色显示AFB1长期慢性暴露显著增加SD大鼠肝脏Gankyrin mRNA及蛋白表达。　　3. HCC患者肿瘤组织中Gankyrin表达水平一定程度随MC-LR内暴露水平的升高而增加，但变化不明显（P＞0.05）。MC-LR长期慢性暴露促进L02细胞增殖及迁移（100 nM MC-LR染毒细胞克隆形成率约为对照组的18倍，P＜0.05），且具有明显的时间及剂量依赖性。MC-LR长期慢性暴露促进裸鼠肿瘤的形成，且暴露浓度越高，细胞成瘤性越强。MC-LR长期染毒促进L02细胞Gankyrin转录水平的上调（约升高1.2-1.7倍）及Gankyrin蛋白表达的升高，且具有明显的时间及剂量依赖性。Gankyrin敲低抑制MC-LR长期染毒L02细胞增殖及迁移（伤口愈合率降低约23-30％，P＜0.05）。10 μg/ kg MC-LR长期暴露诱导SD大鼠肝损伤及肝癌前病变的发生，并促进SD大鼠肝脏Gankyrin表达水平的升高（1.8-3.8倍）。　　主要结论：　　1. AFB1长期低剂量暴露能诱导正常肝细胞发生恶性转化并促进动物肝脏损伤及HCC的发生；低剂量MC-LR长期暴露能一定程度诱导细胞发生恶性转化及动物肝脏损伤；二者联合暴露能有效降低AFB1引起的细胞恶性转化及肝脏损伤，并抑制AFB1导致的HCC发生，具有明显的拮抗效应，其机制可能与MC-LR抑制CYP基因的表达，减少AFBO-DNA加合物的形成，从而导致AFB1的致癌效应减弱有关。　　2. 血清AFB1内暴露水平与HCC患者中Gankyrin表达水平呈现正相关关系；AFB1长期慢性暴露可通过激活 Gankyrin/β-catenin 信号通路及其下游信号分子从而诱导肝细胞L02恶性转化及大鼠肿瘤的形成。　　3. HCC患者随血清MC-LR水平升高Gankyrin表达有升高趋势；MC-LR长期暴露能诱导人正常肝细胞的恶性转化并促进SD大鼠肿瘤病变，其主要机制与MC-LR诱导的癌基因Gankyrin表达升高有关。　　创新点：　　1、本研究在细胞及动物水平研究了两种毒素单独或联合低剂量长期暴露致肝癌的不同效应，发现 AFB1 致肝癌效应最明显，MC-LR 可致肝癌前病变但未见肝癌发生，我们首次在长期慢性染毒细胞及动物模型上发现两毒素联合暴露致肝癌的拮抗效应。并解释了其中可能的机制由于MC-LR抑制了AFB1活化的CYP关键酶，导致AFBO-DNA加合物形成减少，抑制了AFB1的致肝癌效应。　　2、本研究首次证明了人体内血清内暴露 AFB1 及 MC-LR 水平与肝脏原癌基因Gankyrin表达的关联。发现AFB1与Gankyrin表达水平呈显著正相关，而MC-LR相关性不显著。提示Gankyrin在AFB1及MC-LR致肝癌过程中发挥重要作用。在细胞水平验证了 Gankyrin 在两毒素恶转细胞过程中的作用及机制。并在动物水平进一步验证了AFB1及MC-LR与Gankyrin表达的关系。　　3、本研究首次证明了AFB1可能通过增加活性氧ROS导致Gankyrin表达升高，从而激活了下游β-catenin信号通路及相关下游信号分子的表达，最终导致了肝癌的发生发展。　　进一步研究方向：　　在细胞及动物水平进一步证明AFB1与MC-LR联合拮抗效应的机制，通过过表达或抑制CYP酶后观察对联合效应的影响，并检测AFB1与MC-LR代谢产物的变化。并尝试多种剂量的组合深入研究AFB1与MC-LR联合暴露的效应及可能的机制。进一步增大样本量，验证MC-LR内暴露水平与原癌基因Gankyrin的关系，并研究两种毒素联合暴露情况下，人群Gankyrin基因等指标的变化。分析AFB1与MC-LR暴露及Gankyrin表达水平与HCC患者肿瘤分期分级及预后的关联。