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转基因技术从产生到现在,经历了几十年的发展过程,特别是近十年来,更是有了突飞猛进的发展。研究人员对转基因动物的要求已经从最初的获得转基因动物转化成为利用转基因技术为人类优质生活服务的目标上来。目的:本实验研究对象为类胰岛素样生长因子I(IGF-I)转基因细毛羊及其后代,以导入到宿主体内的外源基因IGF-I为研究目标,通过对IGF-I转基因细毛羊外源基因的整合位点、拷贝数、转录和翻译水平进行研究,旨在为外源基因的功能研究奠定基础,为转基因细毛羊的高效生产提供借鉴。方法:试验一:对本实验室构建的IGF-I转基因细毛羊及其后代进行阳性个体鉴定。根据外源基因质粒序列设计特异性引物,采用PCR法对本实验室构建的转基因细毛羊进行阳性个体鉴定。试验二:利用实时荧光定量PCR技术,设计实时荧光定量PCR引物,对鉴定结果为阳性的转基因细毛羊外源基因拷贝数进行检测。试验三:通过相对实时荧光定量PCR技术对转基因细毛羊皮肤组织IGF-I m RNA表达水平进行分析。试验四:利用Western免疫印迹法,通过对外源基因在转基因细毛羊皮肤组织及内脏蛋白的表达定量分析,对外源基因翻译水平进行检测。试验五:采用染色体步移技术,提取转基因细毛羊基因组DNA,对外源基因在IGF-I转基因细毛羊基因组DNA上的整合位点进行分析。结果:试验一:结果表明:转IGF-I基因细毛羊0152、0016、118、0217四只细毛羊均为IGF-I转基因细毛羊。试验二:结果表明:IGF-I转基因细毛羊0152、0016、118、0217外源基因的拷贝数分别为3、1、1、1。实验三:结果表明:IGF-I基因在皮肤组织中的相对表达量在IGF-I转基因细毛羊0152、0016、118、0217分别为对照组细毛羊相对表达量的2.87倍、2.03倍、1.86倍和1.85倍,差异均极显著(P<0.01)。转基因原代羊0016皮肤组织中IGF-I基因的表达量分别是一代羊118和0217的178.9%倍和150%,差异极显著(P<0.01);转基因原代羊0152 IGF-I基因在皮肤组织中的相对表达量分别是其后代118和0217的207%和174%,差异极显著(P<0.01)。原代羊0152与0016皮肤组织中IGF-I基因的相对表达量差异不显著(P>0.05);一代羊118和0217皮肤组织中的IGF-I基因相对表达量差异不显著(P>0.05)。实验四:结果表明:IGF-I蛋白在IGF-I转基因细毛羊0152、0016、118、0217皮肤组织的相对表达量分别为1.55、1.08、0.55、0.62,其表达量分别为相同年龄普通细毛羊的213%、187%、129%、127%,差异均极显著(P<0.01)。IGF-I转基因细毛羊0152内脏器官IGF-I蛋白表达与普通细毛羊比较结果显示:IGF-I蛋白在转基因细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和皮肤的相对表达量分别为0.348、2.571、0.863、0.731、0.316、0.124、0.481,普通细毛羊IGF-I蛋白相对表达量在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和皮肤相对表达量分别为0.357、2.564、0.847、0.727、0.304、0.127、0.215,除在皮肤组织IGF-I蛋白相对表达量IGF-I转基因细毛羊0152为普通细毛羊223.8%,差异极显著(P<0.01),其余组织器官IGF-I蛋白的相对表达量在转基因细毛羊0152和普通细毛羊之间差异不显著(P>0.05)。实验五:结果表明:外源基因插入位点在IGF-I转基因细毛羊0152基因组DNA第18号染色体7097202-7097206之间。结论:通过IGF-I转基因细毛羊基因稳定性分析,结果表明外源基因成功整合到细毛羊基因组中,并且随着宿主稳定遗传给其后代。外源基因在转基因原代羊和一代羊体内在转录水平和翻译水平均能够稳定表达,其表达在皮肤组织具有特异性。