背景骨质疏松主要的特征是骨量减少和骨微结构破坏,导致骨脆性增加同时易于骨折的代谢性疾病。随着老龄化社会的发展,骨质疏松患者不断增多,如何有效预防和治疗骨质疏松已经成为国内外的热门话题。根据原林教授提出的“筋膜学说”：人体可以看做是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架构成的支持与储备系统与被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。建立在各种功能细胞的专能特化的基础上的功能系统是被以筋膜支架中未分化的干细胞为核心的支持与储备系统支持和包绕的。支持与储备系统内未分化干细胞在微环境下通过分化为各种定向干细胞,源源不断的为功能系统中各种功能细胞的更新提供细胞源泉,同时为功能系统中的各种功能细胞的代谢提供营养,维持其内环境的稳定。因此,在支持与储备系统的支持下功能系统才可能维持结构和功能的稳定,当某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新细胞的补充,出现代谢障碍,机体就可能会出现相应的病变。骨质疏松的发病机制正是在骨组织吸收后,筋膜结缔组织支架中未分化的干细胞未能充分向成骨细胞分化,造成骨形成不足而出现的一种疾病。因此,如何干预骨代谢过程中出现的负平衡,如何有效保证并增加筋膜结缔组织支架中未分化的干细胞,使成骨细胞得到有效的补充,促进骨的形成,重建骨的正平衡是治疗骨质疏松的关键。目前,骨缺损的修复仍是骨科临床中的棘手难题之一,以往研究显示采用骨移植治疗骨缺损的方法取得了一定的效果,但此方法存在较大的局限性。自体骨移植一直以来都被认为是骨缺损修复的一个金标准,由于植取骨量有限,已形成供区畸形,取骨手术也同样增加了患者的创伤痛苦；异体骨移植虽然取材方便,易获取,可减少手术次数,但是由于其具有抗原性,可引起机体的免疫排斥反应,同时存在着潜在传播疾病的风险,故异体骨移植的并发症也较多,如感染、骨折、骨不愈合等等。因此,人们对新型移植替代物的需求也不断增加。目前各种骨水泥已经备受青睐。伴随人口老龄化的发展,骨质疏松症已成为威胁着中老年人健康的主要疾病。骨质疏松极易并发骨折,同时这骨折也常伴有松质骨压缩及骨缺损。伴随着骨质疏松绝对人口的增加,因各种原因引起的骨缺损合并骨质疏松的患者也逐年增加。当机体骨质疏松时,由于破骨细胞活性增强,骨的吸收大于骨的形成,故新骨生成能力下降,导致骨质疏松骨缺损的愈合时间明显延迟,而新生骨痂减少,愈合后的骨生物力学强度差,容易骨折。与常规骨缺损的治疗相比,治疗骨质疏松骨缺损的花费要更大且传统方法疗效欠佳。骨水泥已逐渐被应用到骨质疏松骨折骨缺损的辅助治疗中,它一方而可增强固定螺钉,防止骨质疏松骨折内固定的松动,另一方面填充骨折的缺损,使其复位及愈合更好,减少发生骨折后遗症。磷酸钙骨水泥近几年也被应用于椎体成形术来治疗骨质疏松椎体压缩骨折,且疗效良好。缓释性骨长因子也渐渐被应用于骨质疏松骨缺损的治疗中,这显著加速了骨缺损的愈合,还在一定程度上改善局部的骨质疏松,增强局部骨生物力学,降低骨折的发生几率。脂肪组织同样也是两系统理论中的支持与储备系统中重要组成部分,其分离出的脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是筋膜结缔组织支架中未分化干细胞的一种重要储备形式。脂肪源干细胞的研究逐渐成为干细胞研究的热点。脂肪源干细胞易于获取,便于分离培养；具有多向分化潜能,能跨胚层分化为三胚层内的组织细胞,在特定的环境中可以向成骨、成软骨、成脂、成肌和成神经等诱导分化：具有免疫原性低和调节免疫功能。此外,骨髓间充质干细胞相比,脂肪源干细胞来源更广泛,获取更容易,对于病人而言,带来的创伤和痛苦更小。这些特征为脂肪源干细胞的同体及异体移植提供了更有利条件。因此,通过增加机体筋膜结缔组织内的未分化的脂肪源干细胞,促进其成骨分化,增加骨形成,可能会对骨质疏松起到预防和治疗作用。利用糖皮质激素建立骨质疏松模型是目前国际上比较公认的骨质疏松症药物模型。长期注射大剂量的糖皮质激素可引起体内钙磷代谢的紊乱,促进甲状旁腺素的分泌,抑制骨保护素的分泌,抑制成骨细胞增殖和活性,增加破骨细胞数量和活性等多种途径促使骨形成减少,骨吸收增加,从而导致骨质疏松的发生。为了探讨异体脂肪源干细胞移植及不同骨填充材料对骨质疏松的预防和治疗作用,本实验通过观察异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠体内血清钙及磷代谢、骨密度、骨生物力学及骨组织形态计量学等方面的影响进行综合评价,同时通过观察不同填充材料对去卵巢骨质疏松大鼠的骨切片的影响,探索一种新的骨质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。目的1、体外分离培养腹股沟皮下脂肪源干细胞,并对其进行多向分化能力和表面标志的鉴定,以判断在支持与储备系统中是否存在未分化的脂肪源干细胞；2、通过对骨密度检测,判断长期给予糖皮质激素是否成功模拟建立骨质疏松模型?3、通过检测大鼠钙、磷、碱性磷酸酶,观察异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的骨体内钙、磷代谢和骨形成的影响；4、通过检测实验大鼠的骨密度,观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨质量的影响；5、通过检测三点弯曲试验,观察移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的骨强度和骨刚度的影响；6、通过对骨组织形态计量学观察,探索异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织微环境的影响；7、为进一步证实“筋膜学说”中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治疗退行性和衰老性疾病”提供部分实验依据。8、通过不同骨填充材料对去卵巢大鼠进行填充后进行相应骨形态学观察,筛选最佳骨材料,为临床新材料的应用提供部分依据。方法1、取成年SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫,I型胶原酶消化,体外分离培养筋膜结缔组织中脂肪源干细胞。分别通过形态学、成脂成骨诱导分化及利用流式细胞术对表面抗原CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106进行鉴定4代脂肪源干细胞,判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。2、40只SD雌性大鼠随机分成空白对照组(A组)、模型组(B组)、治疗组(C)和治疗对照组(D组)。B、C和D组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注射液8mg/kg,3次/周；A组给予颈背部皮下注射生理盐水0.8mL,3次/周。12周后,将A组和B组处死取材,判断造模是否成功。3、模拟骨质疏松模型成功后,收集传至第4代的脂肪源干细胞,经尾静脉向C组大鼠每只注射脂肪源干细胞3×106个,D组大鼠每只注射1mL生理盐水,4周后处死取材。4、应用水合氯醛麻醉大鼠后,用促凝管接取心脏血液,室温下放置8h后3000r/min,离心15min后制备血清,分装后-70℃保存。全自动生化分析仪分别利用偶氮砷Ⅲ法、磷钼酸比色法及速率法测定血清中钙、磷和碱性磷酸酶的含量。取血完毕后,采用心脏放血处死,分别取出大鼠双侧股骨和第三至第五腰椎,去除周围肌肉组织。利用双能X线骨密度仪小动物测量软件测定腰椎和右侧股骨的骨密度值。利用BOSE生物材料动态力学试验机对左侧股骨进行三点弯曲实验,股骨背侧向上,腹侧向下,跨距为18mm,速率为0.05mm/s,股骨压断时记录最大载荷和刚度值。5、处死大鼠后取出右侧胫骨上1/3部分,手术刀片矢状面剖开,固定后酒精逐级脱水,分别浸入浸液I(甲基丙烯酸甲酯70mL+邻苯二甲酸二丁酯30mL)、浸液Ⅱ(浸液I+过氧化苯甲酰1g)和浸液Ⅳ(浸液Ⅰ+过氧化苯甲酰2.5g)各2d,再用新鲜配制的浸液Ⅲ进行包埋。Jung K重型切骨机连续切取6μm厚度切片,分别进行组织学观察(Gemisa染色)和类骨质观察(von Kossa染色)。测量区域为生长板下1mm至4mm范围内,采用Lecia QWin多功能彩色病理图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。具体参数包括骨小梁相对体积(BV/TV)X骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)和单位骨小梁破骨细胞数(OC.N),均采用国际通用的公式进行计算。6、骨质疏松模型手术：正常雌性大鼠全麻成功后,腹部剃毛,碘伏消毒。下腹正中切口,逐层进入腹腔。找出一侧卵巢结扎切除。同法切除另一侧。缝合腹膜及腹肌,最后缝合皮肤。一周拆线。3个月后即为骨质疏松模型。7、待模型建立成功后,做材垂直骨面钻孔深5毫米建立骨隧道。于隧道内植入材料并轻轻压实至骨面,然后用骨蜡封堵料植入手术：全麻成功后双下肢膝周前内侧剃毛。碘伏消毒。从膝部沿胫骨前棘切口长约2cm。逐层进达骨膜下,骨膜下剥离显露胫骨近端前内侧面,用直径3毫米钻头。止血,冲洗,选取四种生物材料： β-磷酸三钙(p-TCP);硅酸钙(CS),降解后,释放有益元素硅；掺锶硅酸钙(Sr-CS),降解后,释放有益元素硅、锶；45s5生化陶瓷玻璃进行填充骨缺损。缝合伤口。9周后处死取材。8、应用HE染色、Giemsa、T-blue、Van gieson、番红O&固绿进行染色。观察不同填充材料骨切片形态学变化。结果1、经光学显微镜观察,原代培养的ADSCs在24h后大部分可贴壁,细胞呈梭形、圆形、多边形等。细胞长势良好,7d后可以1：3比例传代,之后每3d传一次代。经换液传代至第4代,可见细胞形态均一,呈纺锤形或者多角形。体外可以向成脂、成骨诱导分化。流式细胞术检测发现CD29和CD90呈强阳性,CD106呈弱阳性,CD11b、CD45和CD49d呈阴性。2、长期大剂量给予糖皮质激素后,与空白对照组大鼠血清钙(3.63±0.20)、血清磷水平(3.12±0.83)和碱性磷酸酶水平(203.8±40.36)、腰椎骨密度(162.70±14.77)、股骨骨密度(254.40±28.95)、骨强度(98.22±10.72)和骨刚度(192.66±42.28)比较,模型组大鼠血清钙(2.60±0.18)和碱性磷酸酶水平(149.50±22.21)、腰椎骨密度(115.70±16.87)、股骨骨密度(183.40±12.28)、骨强度(58.88±12.53)和骨刚度(127.53±19.13)均显著降低,而血清磷水平(5.25±1.11)显著上升(P<0.05)；骨小梁变细、变薄,骨小梁排列紊乱,骨小梁间出现断裂,间距增大,出现陷窝；骨小梁的数量(4.95±0.75)、相对体积(17.31±3.66)和厚度(35.82±3.88)均显著降低(P<0.05),而骨小梁的分离度(171.30±29.72)增高,单位骨小梁破骨细胞数(52.70±10.34)增多(P<0.05)。3、异体移植脂肪源干细胞后,与模型组比较,治疗组大鼠血清钙(3.01±0.30)和碱性磷酸酶水平(202.5±40.82)、股骨骨密度(226.50±25.54)、(腰椎骨密度149.30±12.52)、骨强度(80.37±9.37)和骨刚度(187.10±30.06)均显著增加,而血清磷水平(2.84±1.78)显著降低(P<0.05)；骨小梁数目增多,骨小梁变厚变粗,骨小梁间出现连接,陷窝减少；骨小梁的数量(6.42±1.24)、相当体积(25.00±4.88)和厚度(39.63±4.16)显著增加,而骨小梁分离度(124.72±29.79)显著降低,单位骨小梁破骨细胞数(29.52±8.38)减少(P<0.05)。4、各种染色结果显示p-磷酸三钙组9w无炎症反应；而CS硅酸钙和Sr-CS掺锶硅酸钙：相对TCP有较多的成骨,但9w仍有炎症反应。结论1、两系统理论中的支持与储备系统中含有脂肪源干细胞,并且这种干细胞是一种未分化的间充质干细胞；2、长期给予大剂量的糖皮质激素可以模拟骨质疏松模型；3、通过移植异体脂肪源干细胞可有效改善体内钙、磷代谢,增加骨形成,有效预防和治疗骨质疏松,为临床上骨质疏松的研究和治疗提供了一种新的研究思路和方法；4、对“筋膜学说”中“通过动员筋膜结缔组织中储备的未分化干细胞可治疗退行性疾病”提供了部分实验依据。5、不同的骨填充材料,对骨创伤面影响不同。新材料CS和Sr均可促进骨形成。为临床上骨质疏松的研究和治疗提供了一种新的研究思路和方法。综上所述,移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠有一定的治疗及预防作用,能够促进骨形成,增加骨密度,改善骨生物力学性能,增强骨强度,降低骨折的发生率。本实验进一步提示在骨质疏松的研究中应该更加关注提高机体干细胞的数量和促进干细胞向成骨细胞分化及骨组织的形成方面,为临床上治疗骨质疏松提供了一种新的研究思路。同时,不同填充骨质疏松骨缺损的新材料填充后骨切片对比,新材料CS和Sr均可促进骨形成。为临床上骨质疏松的研究和治疗提供了一种新的研究思路和方法。