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新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性禽类传染病。ND发病的主要特点为呼吸困难、拉稀、神经机能紊乱、粘膜和浆膜出血坏死,具有较高死亡率,对禽类生产造成严重的危害。因此,建立一种简单、快速、准确的NDV检测方法对ND防控以及养禽业的发展具有非常重要的意义。重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Ploymerase Amplication,RPA）是一种新型核酸等温扩增技术,具有操作简单、特异性高、敏感性强和不依赖复杂仪器的优点,同时扩增产物易形成气溶胶造成假阳性污染。而全封闭式横向流动试纸条技术（lateral flow dipstick,LFD）是将核酸试纸条置于方便携带的密闭装置中,可避免核酸产物外泄造成的假阳性污染。本研究将RPA技术与LFD技术相结合,通过对反应条件的优化,建立了一种针对NDV的RPA-LFD快速检测方法,对该方法的特异性、敏感性进行了研究和分析,并将该方法进行临床初步应用。研究结果如下:1.NDV RPA-LFD检测方法的建立:本研究根据RPA引物设计原则,针对NDV F基因保守区域设计3对引物,以NDV F48E9株的cDNA为模板,将引物两两组合分别进行RPA反应,通过凝胶电泳检测方法对引物进行筛选并建立RPA凝胶电泳反应体系。再按照nof探针设计原则,选择一条最佳引物作为RPA-nof探针,建立NDV RPA-LFD反应体系。为了确定该检测方法的最适反应条件,我们设计了不同的反应温度、时间、引物和探针的终浓度,对NDV RPA-LFD检测方法反应条件进行优化。综合优化结果,我们选择37℃作为该检测方法反应温度,20 min为该检测方法的反应时间,420 nM、120 nM分别为该检测方法的引物和探针的终浓度。我们以NDV的F48E9株、GM株、Lasota株的cDNA为模板,按照已经确定的优化条件,分别进行RPA-LFD反应,并以ddH2O为空白对照。结果显示,NDV 3种毒株LFD检测装置内检测线和质控线都有两条红色条带,而ddH2O仅在质控线出现一条红色条带,即NDV 3种毒株检测结果均为阳性,表明本研究成功建立了NDV RPA-LFD检测方法,且具有较广的适用性。2.NDV RPA-LFD检测方法特异性、敏感性的研究:将所建立的NDV RPA-LFD检测方法对NDV、禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）、鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、马立克氏病毒（Marek’s disease virus,MDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）、沙门氏菌、大肠杆菌其它相关病原进行检测。结果显示,NDV LFD检测装置内检测线和质控线都有两条红色条带,而其它相关病原仅在质控线出现一条红色条带,即该方法对NDV检测结果为阳性,其它相关病原检测结果为阴性,表明NDV RPA-LFD检测方法具有良好的特异性。我们进一步将NDV RPA-LFD检测方法与常规PCR琼脂糖凝胶电泳法、RPA琼脂糖凝胶电泳法进行敏感性比较。结果显示,常规PCR琼脂糖凝胶电泳法、RPA琼脂糖凝胶电泳法、RPA-LFD检测方法可以检测到NDV重组质粒最低检测浓度分别4.46×104 copies/μL、4.46×103 copies/μL、4.46×103 copies/μL;可以检测到NDV的cDNA最低含量分别为66.7 pg、66.7 pg、6.67 pg,表明NDV RPA-LFD检测方法比常规PCR琼脂糖凝胶电泳法更具敏感性。3.NDV RPA-LFD检测方法临床样品的应用:采集23份疑似ND病料,用RPA-LFD方法和常规PCR琼脂糖凝胶电泳法进行检测。结果表明,NDV RPA-LFD方法检出12份阳性,常规PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检出14份阳性,NDV RPA-LFD检测方法与常规PCR琼脂糖凝胶电泳法检测临床病料的阳性符合率为85.7%,表明NDV RPA-LFD检测方法在临床应用上是可行的。综上,本研究通过反应条件的优化,建立了一种NDV RPA-LFD快速检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行研究,临床初步应用进行分析。结果表明,NDV RPA-LFD检测方法具有操作简单、费时少、不需昂贵仪器,结果准确、可视化等优点,适合NDV基层临床检测。