睾丸的精子发生是一个独特复杂的细胞分裂分化过程。睾丸生精小管中的生精细胞先后经过三个阶段的变化：精原细胞的增殖，精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态过程，最终产生成熟的精子。许多在睾丸中特异或高度表达的基因参与这一过程。 克隆睾丸精子发生相关基因并研究其功能，对于揭示精子发生过程中减数分裂和变态的分子机制，对于临床男性不育的诊断和治疗以及男性分子节育等均具有重要的意义。 为了克隆组织中表达的新基因，许多基于基因差异显示的方法，如抑制性差减杂交(SSH)，差异显示逆转录PCR(DDRT-PCR)和cDNA microarray杂交技术等已得到了应用和改进。本实验室利用人睾丸cDNA microarray，比较了人胚胎期睾丸和成年期睾丸的基因表达差异，筛选出1522个差异表达的克隆，从中克隆了40条与睾丸发育和精子发生相关的新基因。在此基础上，本研究从中选择了两条在成人睾丸高表达的新基因(睾丸特异的有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白基因(tsMCAK)和NYD-SP16基因)进行了初步的功能研究。 第一部分 tsMCAK基因的研究 有丝分裂期染色体的分离是通过纺锤体(由许多微管和相关的驱动蛋白相关蛋白组成)的动力学过程完成。在这些驱动蛋白相关蛋白中，有一类蛋白的结构中有一个位于中央的运动元结构域，在人体细胞、小鼠、仓鼠、非洲蟾蜍、硅藻等物种中均已发现了这个家族的成员。研究表明仓鼠和人的有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白对于染色体的 南京医科大学博士学位论文分离和细胞的分裂、增殖过程是必不可少的，但这类蛋白和睾丸功能的关系尚未见报道。 本研究在人睾丸cDNA micro啊差异杂交的舢上，克隆出一条新的成人辜丸高表达的人有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白基因 （HsMCAK）的不同剪接体。由于其在睾丸特异表达，故命名为睾丸特异的有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白 ＊estis s耶cific MCAK，tSMCAK），是驱动蛋白相关蛋白家族中的新的一员。 tSMCAK克隆的咸人睾丸探针和胚胎睾丸探针杂交信号分别为45．84和12．65，成人睾丸中的表达水平比胚胎睾丸高2．62倍，是成年期睾丸高表达的基因／SMC从C洲A全长2401 hp，开放阅读框2013hp，编码蛋白质有 671个氨基酸。tsMCAK序列已输入 GenBank，接收号为AY026505。序列分析显示：tSMCAK和人体细胞的HSMCAK基固高度同源；氨基酸序列完全同源，仅比HS＊＊AK蛋白少躺端54个氨基酸；两者都有一个位于中央的驱动蛋白运动元结构域，且结构域的氨基酗列两者完全相同。基固剪接分析揭示 tSMCAK基因是HsMCAK基因在睾丸组织中的不同剪接产物。 tsMCAK基因定位于 IP34。人多重组织 RTPCR显示 tsMCAK基因仅仅在睾丸组织特异高表达，其它组织未见表达。tsMCAK基固在生精障碍患者睾丸内的表达结果显示 tSMCAK基因的表蛐失与男性不育相关，并证实tSMCAK在生精细胞特异表达。蛋白和保守结构域的完全同源性提示睾丸中表达的tSMCAK基困的功能应该与体细胞中HSMC脓基因的功能是一样的，可能在精子发生过程中tSMC从 二 南京医科大学博士学位论文对染色体的分离和生精细胞的增殖和分裂起非常重要的作用。 总之，is＊＊AK基固是睾丸特异的驱动蛋白相关蛋白的后选基因。tsMCAK基困在成年期辜丸生精细胞的特异高表达和睾丸的精子发生密切相关，它的表达缺失和临床男性不育相关。tSMCAK的确切功能机制还有待进一步研究。第 H部分 NYDSn 6基因的研究 一 本研究在人睾丸 cDNA microarrny差异杂交的基础上，克隆了一条新的成人睾丸高表达的基因，命名为 N’YD石P。 NYDEP克隆的成人睾丸探针和胚胎睾丸探针杂交信号分别为28．16和3．78，咸人睾丸中的表达水平比胚胎睾丸高6．44倍，是成年期睾丸高表达的基因。N’－－－E CmA全长1595 hp，含有一个762 hp的开放阅读框，编码一个 254个氨基酸的蛋白质。NYDS序列已输入怔nB毗，接收号为 AY027526。序列分析显示 N’YDSP与小鼠睾丸基因 AK006554的核菩晰列及其编码蛋白 BAB2465的氨基朗列有高度同源性（＞80％八表明NYDS16是一条人－小鼠同源基因。 NYDS＊6基因定位于sql4。多重组织PCR和膜杂交结果显示N’YDSP基因在睾丸和胰腺高表达，其它组织很少或没有表达。结构域分析椎测 NYDEP蛋白含有一个跨膜结构域。通过构建绿色荧光融合蛋白重组质粒并转染人缄毛膜癌JAR细胞株，结果显示NYDS16融合蛋白亚细胞定位于M细胞的细胞膜上，证实 3 南京医科大学博士学位论文NYDSP蛋白是一种膜蛋白。 不同发育阶段小鼠睾丸同源基因AK006554表达水平的实时定量PCR结果显示＊、鼠睾丸中 AK006554 勺表达量从 1周到 4周再到 7周是显著增加的，可能与睾丸发育相关；7周