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支气管哮喘是全球常见的慢性炎症性疾病之一,逐渐成为公共医疗系统的负担。长效β2激动剂联合糖皮质激素主要用于治疗哮喘,但随着病情反复发作,药物频繁使用致耐受性增加。因此,探寻疗效稳定,安全性高,预防性好的平喘药物,已成为该领域持续的热点问题。中药治疗哮喘历史悠久且方法多样,其中穴位贴敷法已沿用上千余年。本课题组基于“重大新药创制”项目研发的麻芥巴布膏外用贴敷肺俞穴能有效延长卵清蛋白（OVA）致敏BN大鼠和C57小鼠的引喘时间,改善肺通气功能,降低外周及肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量。与同期口服给药组比较,两者均可明显降低气道对乙酰胆碱（Mch）的反应性,并通过纠正Th1/Th2平衡、Treg/Th17平衡失调减轻炎症反应而控制病情。这说明麻芥巴布膏“经皮治肺”确有良好疗效。之前本课题组的研究主要集中在与哮喘相关的适应性免疫反应上。然而,随着非Th2型哮喘的发现和先天淋巴细胞（innate lymphoid cells,ILCs）在其发病机制中的参与,先天免疫反应已成为哮喘研究的焦点。ILCs可分为细胞毒性细胞和辅助细胞样细胞。细胞毒性ILCs由自然杀伤（NK）细胞组成,而辅助样ILCs可进一步细分为三个亚群,即第一组ILCs（ILC1s）、第二组ILCs（ILC2s）和第三组ILCs（ILC3s）。本研究主要探讨麻芥巴布膏调控辅助样ILCs缓解先天免疫反应介导的哮喘炎症的作用机制。目的1.研究麻芥巴布膏对先天免疫反应介导的哮喘炎症的药效作用。2.研究辅助样ILCs在哮喘模型中的变化及麻芥巴布膏对其的影响,丰富膏药防治哮喘的机制研究。3.研究麻芥巴布膏干预哮喘状态下炎症因子及上皮源性细胞因子的变化,以及对STAT5通路、p38 MAPK通路的影响。方法1.麻芥巴布膏的制备及药效评价:制备麻芥巴布膏,建立木瓜蛋白酶诱导的哮喘Rag1-/-小鼠模型。麻芥巴布膏干预后,进行行为学评分,计算脾指数,ELISA检测血清HIS和IL-9的含量,HE染色检测肺组织病理。由此进行模型的评定及药效评价。2.辅助样ILCs转录因子及细胞因子的检测:qRT-PCR法检测木瓜蛋白酶诱导的哮喘模型下及麻芥巴布膏干预后肺组织中ILC1s、ILC2s、ILC3s的转录因子T-bet mRNA、GATA3 mRNA、Rorα mRNA、Rorc mRNA 及细胞因子 IFN-γ mRNA 和 IL-17 mRNA 的表达。WB法检测肺组织中T-bet蛋白的表达。3.炎症因子、上皮源性细胞因子及相关通路的检测:ELISA法检测木瓜蛋白酶诱导的哮喘模型下血清中上皮源性细胞因子IL-33和IL-25的含量,qRT-PCR法检测肺组织中TSLP mRNA的表达。WB法检测肺组织中p38及其磷酸化、STAT5及其磷酸化的表达。炎症因子芯片试剂盒检测肺组织中40个炎症因子含量变化。结果1.肺组织病理结果显示,空白对照组的肺组织结构完整,肺泡正常,肺间质无渗出物,无炎症细胞浸润。哮喘模型组的肺组织结构轻度异常,部分肺泡萎缩塌陷,肺泡壁轻度增厚,并可见少量炎症细胞浸润。麻芥巴布膏组效果良好,炎症细胞数量减少,肺泡壁增厚减轻,表明麻芥巴布膏可以减轻木瓜蛋白酶引起的哮喘炎症。与空白对照组相比,哮喘模型组行为学评分增高（P＜0.01）,麻芥巴布膏干预后行为学评分降低（P＜0.01）。与空白对照组相比,哮喘模型组脾指数稍有上升,麻芥巴布膏干预后脾指数稍有降低,但均没有统计学差异（P＞0.05）。与空白对照组相比,哮喘模型组的HIS的含量明显增多（P＜0.01）,与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏降低了 HIS的含量（P＜0.01）。与空白对照组相比,哮喘模型组的IL-9的含量增多（P＜0.01）,与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏明显降低了 IL-9的含量（P＜0.01）。2.实验结果表明,与空白对照组相比,哮喘模型组的转录因子T-betmRNA、Rorc mRNA及细胞因子IFN-γ mRNA和IL-17 mRNA的表达增多（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）;与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏降低了转录因子T-bet mRNA、Rorc mRNA及细胞因子 IFN-γ mRNA和 IL-17mRNA 的表达（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。与空白对照组相比,哮喘模型组的GATA3 mRNA和Rorα mRNA的表达降低（P＜0.05,P＜0.01）,与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏干预后GATA3 mRNA和RorαmRNA的表达没有显著性差异（P＞0.05）。结果表明与空白对照组相比,哮喘模型组的T-bet的表达增多（P＜0.01）,与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏明显降低了 T-bet的表达（P＜0.01）。3.实验结果表明,与空白对照组相比,哮喘模型组的IL-33和IL-25的含量明显增多（P＜0.01,P＜0.01）;与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏明显降低了 IL-33和IL-25的含量（P＜0.01,P＜0.01）。与空白对照组相比,哮喘模型组的TSLP mRNA的含量没有显著差异（P＞0.05）,与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏降低了 TSLP mRNA的含量,但没有统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组相比,哮喘模型组的p-p38的含量明显增多（P＜0.01）,p-p38/p38比值增大（P＜0.01）;与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏明显降低了 p-p38的含量（P＜0.01）,p-p38/p38比值降低,但没有统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组相比,哮喘模型组的p-STAT5的含量降低（P＜0.01）,p-STAT5/STAT5比值降低（P＜0.05）;与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏增加了 p-STAT5的含量,但没有统计学意义（P＞0.05）,p-STAT5/STAT5比值没有明显变化（P＞0.05）。采用炎症因子芯片检测空白对照组、哮喘模型组和麻芥巴布膏组的肺组织,选择调整后的P值（adj.P.Val）小于0.05且倍数变化超过2或小于0.5（绝对logFC＞1）的差异蛋白,并对其进行GO分析以进行功能富集分析和KEGG通路富集分析。实验结果显示,与空白对照组相比,哮喘模型组中MCSF、IL-13下调;与哮喘模型组相比,麻芥巴布膏组中MCSF、MIP-1a、TIMP-1、MCP-1上调。对以上差异蛋白进行GO功能富集,在生物过程（BP）中主要与蛋白酶结合,金属内肽酶抑制剂活性,G蛋白-偶联受体结合,CCR趋化因子受体结合等相关;在细胞组成（CC）中主要与粗面内质网,内吞囊泡,胶原蛋白,细胞外基质以及神经元相关;在分子功能（MF）中主要与巨噬细胞、粒细胞、白细胞趋化性,巨噬细胞、胶质细胞、单核细胞、粒细胞、髓系白细胞迁移等相关。KEGG通路富集分析结果显示在IL-17信号通路,TNF信号通路,趋化因子信号通路,炎症性肠病,哮喘等显著富集。结论1.麻芥巴布膏可以缓解先天免疫反应介导的哮喘炎症。2.麻芥巴布膏通过降低ILC2s和ILC1s的转录因子及细胞因子的表达来发挥缓解哮喘的作用。该ILC2s亚型具有Rorc活性并产生IL-17A,同时GATA3和Rorα表达下调;ILC1s由T-bet调控,并产生IFN-γ发挥致病作用。3.麻芥巴布膏可降低木瓜蛋白酶诱导哮喘模型中升高的上皮源性细胞因子IL-33和IL-25,通过p38 MAPK通路调节ILC2s;TSLP在组间没有显著差异;哮喘模型组STAT5通路表达减少,可能与ILC2s的异质性有关。