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高血压病是全球流行最广的心血管疾病,抗高血压药能有效的控制血压,防止或减少心、脑、肾等重要器官损伤,从而提高患者的生活质量,延长寿命。
利血平为肾上腺素能神经抑制药,有抗高血压、减慢心率和抑制中枢神经系统的作用。由于降血压作用强,且副作用较大,通常不单独使用,而与其他药物合用,通常与氢氯噻嗪、氨苯蝶啶合用。
三药联合应用有显著的协同作用,能增强利尿降压作用,促进血压下降,提高了疗效,并降低了各药的剂量和不良反应,目前市面上有售这三种成分的复方片剂,即复方利血平氨苯蝶啶片,为临床治疗高血压的常用药物。因此同时测定生物样品中的这三种成分比单独测定各成分更具有研究意义。目前已有的文献中,尚未见同时测定生物样品中这三种成分的报道。在本论文中,分别采用不用的前处理方法,结合高效液相色谱,分别同时测定了人尿样品和大鼠血浆样品中的利血平、氨苯蝶啶和氢氯噻嗪。
本论文的主要研究内容如下:
(1)采用反相高效液相色谱法,建立了简单高效的同时测定尿样中氢氯噻嗪与利血平的方法。前处理采用传统液液萃取方法,样品经蛋白沉淀后用乙酸乙酯进行液液萃取。HPLC方法采用乙腈与0.2%氯化铵溶液为流动相,进行梯度洗脱。在该法下,氢氯噻嗪与利血平的线性范围分别为0.05-20μg mL-1与0.02-5.0μg mL-1(r>0.999)。氢氯噻嗪的检测限与定量限分别为5.5μg mL-1 and18.2 ng mL-1;利血平的检测限与定量限分别为7.1 ng mL-1 and23.6 ng mL-1。所有成分的萃取回收率均高于89.0±1.35%。氢氯噻嗪的日内与日间精密度均分别低于1.91%与1.38%;利血平均分别低于1.61%与2.64%。
该法成功运用于受试者口服9.0mg氢氯噻嗪与1.0mg利血平后尿样中氢氯噻嗪与利血平的测定,并用于药代动力学的初步研究。
(2)建立了串联固相萃取(C18与MCX)前处理方法,结合高效液相色谱,同时测定利血平、氢氯噻嗪与氨苯蝶啶三种成分。采用固相萃取法代替传统的液液萃取,并在固相萃取的基础上进行两种不同SPE柱的串联,对SPE的洗脱条件进行优化,不仅获得了更好的净化效果,同时也解决了待测组分由于酸碱性、极性不同而无法在单个SPE柱上取得理想前处理效果的问题。SPE对样品的净化和富集作用使得各成分均获得了更高的检测限和定量限。HPLC采用乙腈与0.2%乙酸溶液为流动相,进行梯度洗脱,检测波长为265nm。在该法下,各成分的回收率均高于84.2±2.0%,精密度均低于3.8%。
该法成功运用于测定大鼠口服后血浆中氢氯噻嗪、氨苯蝶啶及利血平成分的测定。
(3)串联固相萃取的方法虽然能取得良好的前处理效果,但该法需要分别填装SPE柱并串联起来,操作相对繁琐,因此在第三部分实验中采用操作更简便的分散固相萃取法,将C18与MAX两种固相萃取填料混合,对血浆中的氢氯噻嗪、氨苯蝶啶和利血平进行测定。三种成分通过梯度洗脱,在液相色谱仪上获得了良好的分离和响应值。分别测定了该法的线性范围,检测限,回收率和精密度。该法中三种成分的回收率均高于82.1±2.1%,日内和日间精密度均低于4.1%。与串联固相萃取法相比较,该法获得了更好的精密度与准确度,且操作更加简便快捷。