随着高密度水产养殖的发展,鱼类疾病已经成为制约该行业发展的重要因素。淡水鱼类运动型气单胞菌败血症（motile Aeromonas septicemia,MAS）与弯口吸虫病（Clinostomum disease）（又称黄蛆病,yellow grubs disease）,分别是典型的鱼类细菌性疾病和复殖吸虫病。胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）为我国特有鱼类,属于二级保护动物,同时因其为亚口鱼科鱼类在亚洲的唯一分布,因此胭脂鱼兼具重要的经济价值和研究价值。近年来,上述两种疾病在胭脂鱼养殖过程中时常发生,给鱼苗培育和养殖生产造成了较大损失。本研究针对胭脂鱼养殖场频发的上述两种疾病展开病因学、病理学及免疫应答机制等内容的研究,以期为深入解析宿主对MAS的免疫应答机制和防控胭脂鱼MAS和弯口吸虫病提供新视角和参考资料。1、胭脂鱼运动型气单胞菌败血症初步研究为鉴定某养殖基地患运动型气单胞菌败血症的胭脂鱼幼鱼病原菌,利用传统病原菌分离方法,从患病胭脂鱼内脏和腹水中分离致病菌,采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA和cpn60、rpoB、gyrB基因序列分析并构建系统发育树的方法进行细菌种类鉴定,通过回感实验、半致死量（LD50）实验和16个毒力基因检测确定菌株致病性,同时开展32种药物敏感性试验;为获得胭脂鱼运动型气单胞菌败血症病理材料,对筛选出的健康胭脂鱼幼鱼进行腹腔注射200μL2.0×10⁸ cfu/mL(LD_50-24h)的嗜水气单胞菌菌液,于感染后第4、12、24 h取中肾、头肾、脾脏和肝脏用于组织结构观察,第24 h取中肾、头肾、脾脏和肝脏用于超微结构观察,结合半定量描述方法对不同时间点各组织损伤程度进行评价,以黑色素巨噬细胞中心（melano-macrophage center,MMC）为参考指标,采用定量分析方法描述各组织中MMC响应策略,以评价组织免疫反应水平;为探究诸多病理现象背后的分子机制,对致病菌感染前、后（第4 h）的胭脂鱼脾脏进行转录组分析,使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测19个免疫相关基因在感染后第4、12和24 h的表达情况。主要研究结果及结论如下:（1）从自然发病胭脂鱼幼鱼内脏团和腹水中分离到两株优势菌,经生理生化特征和分子标记鉴定,证实两个菌株分别为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（命名为BBAh1）和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）（命名为BBAv1）。（2）回感实验证实分离到的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均为胭脂鱼MAS致病菌,两个菌株中分别检测到7个毒力基因（aerA、alt、ascV、hlyA、lip、ompA和aspA）和8个毒力基因（aerA、alt、ascV、hlyA、lip、aexT、ast和flaA）,二者对胭脂鱼幼鱼的7天半致死量(LD_50-7d)分别为1.93×10⁵ cfu/g和8.77×10⁵ cfu/g;且嗜水气单胞菌致死性更强,维氏气单胞菌致肠炎比例更高。（3）对32种药物的敏感性实验结果表明,两个菌株药敏特征相似,对28种药物显示出相似的敏感性,这可能与两个菌株来源于同一环境有关;建议使用两个菌株都十分敏感的头孢噻肟、氨曲南、头孢曲松和头孢呋辛等药物来治疗胭脂鱼运动型气单胞菌败血症。（4）MAS的组织显微结构病理特征表现为:内皮细胞损伤、溶血、血液凝集、MMC响应、组织坏死、淋巴细胞浸润、粒细胞胞质嗜酸性增强、肝细胞空泡化、凝固样坏死和胞质嗜酸性变性以及红细胞萎缩变性等;超微结构病理特征表现为:肾小球毛细血管塌陷,系膜细胞肿胀,足细胞增生,滤过装置遭到严重破坏;巨噬细胞功能活跃,表现为大量吞噬各类损伤细胞,包含淋巴细胞和嗜酸性粒细胞;肝脏狄氏间隙遭到严重破坏,肝细胞中糖原消失,线粒体外嗜肿胀,自噬溶酶体增多。上述现象说明:胭脂鱼MAS导致组织发生严重的病理变化,进而导致机体造血、排泄和代谢等功能障碍,是细菌感染致病和致死的主要原因。（5）MAS发展进程中组织MMC响应策略:中肾、头肾和脾脏MMC响应策略基本一致,表现为单个MMC面积越来越大,数量越来越多,相对组织面积越来越大;肝脏MMC响应策略与上述组织存在差别,即感染后12 h内,肝脏中MMC各指标基本无变化,至感染后第24 h,组织中MMC数量和相对组织面积才显著增加（P<0.05）。（6）组织MMC响应策略反映出组织器官免疫应答策略,即脾脏在细菌感染引发的免疫应答中占据主导地位,其次为头肾、中肾,肝脏免疫反应能力最弱;另外,由于脾脏MMC响应最为敏感,因此其更适宜用作评价机体生理状态或免疫水平的生物指标。（7）嗜水气单胞菌急性感染后第4 h,胭脂鱼脾脏共获得1390个显著差异表达基因（q<0.05）,其中907个表达显著上调,483个表达显著下调;随机抽取8个差异表达基因进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR结果与转录组结果表达趋势基本一致,进而证明了转录组数据的可靠性。（8）1390个差异表达基因显著富集于16个二级GO类别,主要为白介素1受体绑定（GO:0005149）、白介素1受体复合物（GO:0045323）、细胞因子受体绑定（GO:0005126）、炎症反应（GO:0006954）、生长因子受体绑定（GO:0070851）和免疫反应（GO:0006955）等;15条KEGG信号通路,主要包含:NF-kB信号通路（ko04064）、TNF信号通路（ko04668）、NOD样受体信号通路（ko04621）、Toll样受体信号通路（ko04620）和炎性肠炎疾病IBD（ko05321）等;上述GO类别和信号通路均与机体免疫反应相关。（9）qRT-PCR检测结果显示:模式识别受体（TLR2、TLR4、TLR6和PGRP5）、白介素（IL1B、IL6、IL8、IL10、IL11和IL12）、趋化因子（CXCL1、CXCL2和CXCL8）、免疫细胞活性调节分子（CD68、CD200、CD247、CSF3和CSF3R）及补体（C6和C7）等诸多免疫相关分子均积极参与到机体抗菌活动中。（10）据转录组和qRT-PCR结果推测胭脂鱼对嗜水气单胞菌感染的免疫应答机制可能如下:病原菌进入机体后,其病原体相关分子模式（PAMP）便被模式识别受体（如TLRs和PGRP5）所识别,接着收到信号的受体细胞开始分泌细胞因子,如IL1和TNF等,这些细胞因子进而激活MAPK信号通路,而MAPK信号通路的激活将直接启动其下游的NF-kB信号通路应答,活化的NF-kB进入核内与靶基因上游特定序列结合从而起始转录,至此机体开始启动强烈的免疫反应来抵御病原菌的进一步感染,组织学层面可见免疫细胞大量增殖,吞噬作用活跃,MMC响应强烈,炎性细胞浸润组织等,但与此同时,MAPK和NF-kB信号通路似乎还启动了负调节机制来避免机体炎症反应过度。2、胭脂鱼弯口吸虫病初步研究本研究从自然发病的人工池塘中随机抽取148尾胭脂鱼幼鱼进行编号和生长指标（全长、体长和体质量）测量;随后通过解剖从鱼体组织中剥离寄生虫包囊,并记录包囊寄生部位和数量用于计算感染率、感染强度、局部感染率和局部感染强度;使用解剖针分离出包囊中的囊蚴并将其保存于70%酒精,后采用形态学（制作囊蚴标本）结合分子生物学方法（CO1和ITS）鉴定囊蚴种类;针对复殖吸虫生活史中第一中间宿主淡水螺类和终末宿主食鱼鸟类,在发病胭脂鱼养殖场进行寄生虫生活史调查。主要研究结果及结论如下:（1）囊蚴形态学和分子标记鉴定结果证实本研究分离到的寄生虫为扁弯口吸虫（Clinostomum complanatum）。这是胭脂鱼乃至亚口鱼科鱼类作为扁弯口吸虫中间宿主的首次记录,且证实囊蚴生殖系统形态特征是鉴别此类寄生虫的可靠形态学依据,CO1（6.87%）较ITS（1.68%）变异位点率更高,鉴别弯口吸虫的效率也更高。（2）抽查样本中共有96尾胭脂鱼受到扁弯口吸虫感染,感染率为64.9%,感染强度为1-7（2.3±1.38）个囊蚴/尾;较躯干部和尾部而言,囊蚴在胭脂鱼头部分布较多,相应的局部感染率和局部感染强度分别为0.557和0.545。（3）感染组与未感染组胭脂鱼在全长和体长上均无显著差异（P>0.05）,就体质量和肥满度而言,感染组（体质量=6.44±0.19 g;肥满度=1.70±0.03 g/cm³）则显著低于未感染组（体质量=10.36±0.51 g;肥满度=2.51±0.03 g/cm³）（P<0.01）。（4）扁弯口吸虫在发病渔场生活史完整:以椭圆萝卜螺（Radix swinhoei）和小土蜗（Galba pervia）为第一中间宿主,胭脂鱼幼鱼为第二中间宿主,食鱼鸟类白鹭（Egretta garzetta）、池鹭（Ardeola bacchus）和普通翠鸟（Alcedo bengalensis）为终末宿主。（5）防治建议:1)年终彻底清塘并用生石灰杀灭螺类,清除池塘引水渠中大量繁殖的宿主螺类;2)在鱼苗、鱼种培育池上方设置防鸟网。综上研究,首次在患运动型气单胞菌败血症的胭脂鱼中同时分离到具有强烈致病性的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌,并根据药敏实验结果筛选出适于治疗胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的药物;通过对嗜水气单胞菌急性感染前后胭脂鱼幼鱼肾、脾和肝脏显微和超微结构变化的观察,发现一系列未见报道的运动型气单胞菌败血症的病理现象,以及组织中黑色素巨噬细胞中心应答情况;通过嗜水气单胞菌刺激胭脂鱼脾脏的转录组分析,以及qRT-PCR对免疫相关基因在感染前后的表达量检测,发现以TLRs和PGRP5为代表的PRRs在早期病原识别中发挥着重要作用,此步骤是激活其下游信号通路、产生免疫应答的关键。本研究还发现胭脂鱼乃至亚口鱼科鱼类为扁弯口吸虫的中间宿主;弄清楚了扁弯口吸虫在发病渔场的完整生活史过程;提出了清塘杀螺、防鸟等防控措施。研究结果丰富了鱼类病害研究内容,为生产实践上防控胭脂鱼此类疾病亦有重要的指导作用。