绞股蓝三萜皂苷生物合成CYP、UGT基因挖掘及表达分析

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:weiwei05516
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目的:目前绞股蓝转录组测序分析已有报道,但缺乏绞股蓝蛋白质表达水平的分析;绞股蓝三萜皂苷生物合成骨架酶基因研究较多,如鲨烯合酶、鲨烯环氧化酶,但缺少对其通路的后修饰酶基因家族如CYP及UDP-依赖性糖基转移酶酶基因的认识,亦缺乏CYP及UDP-依赖性糖基转移酶基因在不同组织的差异性表达的整体分析。本研究从整体的角度分析绞股蓝组织内动态变化的蛋白质组成与活动规律,通过对后修饰酶基因的挖掘并研究其组织差异性表达,为今后绞股蓝三萜皂苷生物合成相关酶基因的靶向表达调控机制研究做铺垫。方法:本研究分别通过ILLumina Next Seq 500及i TRAQ/TMT技术获得绞股蓝转录组数据库及蛋白质定量测序结果,通过联合分析从中挖掘可能参与绞股蓝三萜皂苷生物合成相关的后修饰酶基因,分析其在绞股蓝根、茎、叶差异性表达,同时筛选表达量差异显著的CYP、UGT基因并通过RTPCR进行c DNA全长克隆,结合生物信息学对其编码蛋白进行功能分析及比较,最后利用RT-q PCR验证已成功克隆的后修饰酶基因在转录水平上的组织差异性表达,阐明三萜皂苷生物合成途径的机制。结果:本研究通过绞股蓝蛋白质组测序,总共鉴定了3925种蛋白质,其中对2,537种蛋白质进行了定量。联合前期转录组学测序结果,共挖掘21个三萜皂苷骨架及侧链的后修饰酶基因。通过统计学分析,绞股蓝根、茎、叶之间蛋白质组测序数据库显著性差异基因与转录组显著性差异基因相关性不同,其中GPJ vs GPG在两组学一致性较好,GPY vs GPG、GPY vs GPJ相关性较差。前期绞股蓝转录组数据库总共有641个推定的CYP(CYP450)和178个推定的UDP糖基转移酶作为三萜皂苷后修饰酶基因的候选物;最后挖掘18个CYP显著差异表达基因、11个UGT显著差异表达基因。根据蛋白质组定量测序结果,则挖掘出7个CYP基因、7个UGT基因。结合绞股蓝转录组数据及蛋白质组数据,本研究从绞股蓝中成功克隆了具有完整ORF区的8个CYP家族酶基因及5个UGT家族酶基因及2个部分序列的CYP和2个部分序列的UGT。对克隆成功的拥有全长ORF区的CYP及UGT的编码蛋白质进行生物信息分析,发现均具有CYP或UGT的保守结构域;通过系统发育树分析,发现与葫芦科植物相应基因亲缘关系较近。最后,通过荧光定量PCR进行转录表达分析,结果显示大部分后修饰酶基因在绞股蓝叶及茎中表达量显著高于根,部分基因如UGT91A1、UGT76B1在绞股蓝组织中的表达与之不同,但结果均表明基因表达具有明显的组织特异性。结论:通过转录组测序及蛋白质组学分析是快速挖掘绞股蓝三萜皂苷生物合成后修饰酶基因的良好方法,成功克隆得到8个具有完整ORF的绞股蓝CYP基因c DNA,5个具有完整ORF的绞股蓝UGT基因的c DNA。对上述推演的绞股蓝三萜皂苷合成通路后修饰酶的理化性质、结构特征、功能、系统演化关系及活性位点分析等进行了生物信息学预测。转录水平分析表明,绞股蓝三萜皂苷合成通路后修饰酶基因表达具有组织特性,可为今后进行绞股蓝三萜皂苷生物合成靶向表达调控提供重要信息。
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