研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类起源于造血干、祖细胞的髓系造血系统恶性肿瘤。AML随着新药的不断研发以及造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplntation,HSCT)的应用,AML的治疗效果取得了突破性的进展,当前治疗AML的主要方法是联合化疗以及缓解后的造血干细胞移植。早期大剂量的联合化疗虽然能使许多患者达到完全缓解(Complete remission,CR),但是伴随有严重的副作用,老年患者不能耐受,容易复发。随着大剂量联合化疗、免疫抑制剂及造血干细胞移植的应用,侵袭性真菌感(invasive fungal infection,IFI)染逐年增多,成为AML患者的死亡原因之一。越来越多的证据支持这一观念,AML需建立分层体系,是源于体内存在的一定比例的白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)。与正常的造血干细胞相似,LSCs也具有自我更新能力,并能使外周血和骨髓中的白血病细胞大量生长和增殖。研究认为,AML患者体内的LSCs导致了治疗的失败和AML的复发,这是由于LSCs抵抗化疗。因此,在进一步改善传统放、化疗,以期通过小剂量药物联合作用提高LSCs对药物的敏感性,达到低毒高效的目的,为血液病新治疗方案的研究领域提供越来越多的循证医学证据。Hedgehog (Hh)信号通路是生物进化史上最为保守的信号途径之一。Hedgehog基因有3种同源基因：Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh),分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白[4]。Hh信号通路包含Patched (Ptc)、 Smoothened (Smo)和通路下游的转录因子Ci/Gli、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Fused (Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、类运动蛋白Costal-2(Cos-2)、蛋白激酶A (PKA)等多种蛋白。在正常情况下(无Hh), Ptc抑制Smo的活性,同时全长的Ci/Gli会被PKA、GSK3及CKI磷酸化,并降解为片段化的Ci75,进入细胞核内,抑制下游靶基因的转录。而在有Hh的情况下,Hh与Ptc结合后,解除Ptc对Smo的抑制,导致Smo被PKA、CKI磷酸化并在膜上聚积,同时Smo分子的C-末端发生构象改变,由闭合的无活性的状态转变为开放的有活性的状态,进而激活下游通路。它是调控胚胎发育、组织的形成和造血功能的关键因素。它可影响干细胞,组织细胞的分化、增殖和凋亡。在成人体内,Hh信号通路的活跃对于组织修复与再生是必要的。主要是由于Hh通路下游Gli1转录激活因子可以诱导G1/S细胞周期调节蛋白的表达而促进细胞的增殖；也可以直接诱导抗凋亡因子Bcl-2表达以抑制凋亡；还可直接激活可促进上皮组织向间质转化的因子的转录以提高肿瘤的侵袭性。因此,Hedgehog信号通路的紊乱与恶性肿瘤的形成、生长和维持有关如黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌、恶性胶质瘤等。一些血液系统肿瘤如急性白血病(AML、ALL)、慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)、CLL、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)均是依赖Hedgehog信号通路。近年来有许多研究显示Hh信号通路对于恶性肿瘤干细胞的维持和扩散起着非常重要的作用。Zhao等认为Smo的活化对鼠和人CML干细胞数量的维持是必须的,Smo能增加CML干细胞的数量并使病情恶化,而Smo的缺失则可能是干细胞耗尽。这提示针对Smo的抑制剂可能有效的减少白血病干细胞,从而成为一种有效的治疗手段。伊曲康唑(Itraconazole, ITC)是一种抗真菌药,伊曲康唑作为恶性血液病IFI一线预防治疗药物,通过抑制真菌的固醇生物合成而起作用,其主要机制也同样抑制了Hedgehog信号通路。研究发现,在鼠髓母细胞瘤同种移植肿瘤和抗真菌治疗的患者的血清中,伊曲康唑能显著抑制Hedgehog信号通路的活性,阻止肿瘤的生长。与三氧化二砷联合使用,可协同抑制Hh信号通路。有报道说,伊曲康唑能抑制非小细胞肺癌血管及肿瘤细胞的生长。还有临床研究表明[32],伊曲康唑可用于治疗复发性前列腺癌,并取得较好的效果。因此,对于依赖Hh信号通路的肿瘤,单用伊曲康唑或者联合其他化疗药物用于抗肿瘤的治疗将会有良好的应用前景。蒽环类药物(Anthracyclines)是临床上的常用的一类化疗药,可抑制RNA和DNA的合成,抗瘤谱较广,对多种肿瘤均有作用,属周期非特异性药物,对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用,主要适用于急性白血病、乳腺癌、肺癌等。然而,蒽环类药物有较大的毒副作用如心脏毒性,并且现在出现了白血病细胞对蒽环类药物耐药。目前尚未有蒽环类药物与伊曲康唑联合应用于急性白血病的报道。本实验用KGla细胞作为实验对象,KGla细胞株源于男性AML患者,不能分化,且具有自我更新潜能并具有化疗治疗抵抗性(耐蒽环类药物),可认为KG1α细胞是“白血病干细胞样细胞”。为探讨Hedgehog信号通路是否作为新靶向应用于白血病的治疗,以及联合抑制Hh通路和RNA、DNA合成是否对白血病细胞表现出协同杀伤作用及其机制。本课题,拟采取形态学、分子和细胞生物学等方法系统研究蒽环类化疗药联合Hh抑制剂伊曲康唑对急性髓系细胞株KG1a细胞的生物学效应及可能的分子机理,从而有望为这一靶向于白血病干细胞的低毒高效的新方法应用于白血病防治提供实验基础和理论依据。第一章 伊曲康唑联合蒽环类药物对白血病干细胞样细胞KG1α生物学效应目的研究伊曲康唑(ITC)单药及联合化疗药阿霉素(Adriamycin,ADM)或柔红霉素(Daunorubicin,DNR)对KG1α细胞增殖及凋亡的影响。方法流式细胞仪检测KG1αt细胞表面CD34和CD38抗原的表达；活细胞计数试剂盒(CCK8)法检测不同浓度ITC、ADM、DNR单药及ITC (2、6、15μmol/L)联合ADM(0.30、0.75μmol/L)或DNR(0.6、1.5μmol/L)对人急性髓系白血病细胞株KGla的增殖抑制作用；不同浓度ITC持续处理的KG1α细胞,分别于7、14、21 d观察对集落克隆形成的影响；ADM 0.75μmol/L或DNR1.5μmol/L、ITCμmol/L及二者联合作用KG1α细胞48 h后,瑞氏染色法观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位及细胞周期阻滞情况。统计学方法所有实验均重复3次后,数据以量x±s表示,应用SPSS 17.0软件处理数据,多组间均数比较采用单因设计资料的方差分析,两组均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果KG1α细胞中有CD34+CD38-细胞约96.23%。ITC、ADM及DNR对KG1α细胞具有增殖抑制作用,并且ITC可降低KG1α克隆形成能力,呈剂量依赖。Weeb系数检验,ADM 0.75μmol/L或DNR 1.5μmol/L与ITC 6μmol/L两药联合时,细胞实际存活率夕0%细胞预估存活率,有协同效应；联合组与对照组和单药组相比,KGla细胞形态变化更为明显。ADM 0.75μmol/L与ITC 6μmol/L联合诱导KGla细胞48 h的凋亡率为31.72%±1.58%,均显著高于对照组、ITC单药组和ADM单药组(4.17%±0.74%、4.33%±1.12%、9.53%±1.15%,均P<0.01); DNR 1.5μmol/L与ITC 6μmol/L联合诱导KGl α细胞48 h的凋亡率为32.13%±4.11%,均显著高于对照组、ITC单药组和DNR单药组(3.61%±1.94%、3.52%±1.92%、10.70%±2.15%,均P<0.01)。线粒体膜电位检测中,ADM+ITC组的低红色荧光细胞(P3)比例明显高于对照组、ADM和ITC单药组(18.82%±3.96%比5.02%±2.11%、9.7%±1.56%、7.1%±2.82%,均P<0.01);DNR+ITC组P3区比例也显著的高于对照组和DNR, ITC组(30.84%±4.01%比10.51%±1.97%、9.53%±3.12%、7.0%±1.33%,均P<0.01)。ADM 0.75μmol/L或DNR1.5μmol/L与ITC 6μmol/L联合组与对照组及单药组比明显阻滞细胞于G2期(P<0.05)。结论1.KG1α细胞大部分细胞具有干性,可作为本实验的LSCs模型；2. ITC、 ADM、 DNR单药在一定范围内可以抑制细胞的增殖,并时间和剂量的依赖；ITC可以抑制不同阶段KG1α细胞集落的形成,呈剂量依赖；3.ITC与ADM或DNR合用可明显抑制细胞的增殖,且呈时间和剂量的依赖性；4.ITC联合ADM或DNR后与单药相比增加了KG1α细胞的凋亡率、线粒体的损伤及细胞G2期的阻滞作用。第二章 伊曲康唑联合柔红霉素诱导白血病干细胞样细胞KG1α凋亡机制的研究目的研究伊曲康唑联合化疗药柔红霉素(Daunorubicin, DNR)对急性髓系白血病细胞凋亡的影响及可能的分子机制。方法用蛋白芯片检测各药物处理组凋亡相关蛋白的表达情况。Western印迹检测Sonic Hedgehog(Shh)信号通路相关蛋白Shh和胶质瘤相关癌基因同系物1(Gli1)的表达水平,及凋亡关蛋白Bcl-2、XIAP、SMAC的表达水平。用流式细胞术和westernblot的方法分别检测ABT-199处理DNR+ITC作用KGla细胞后存活的细胞凋亡情况及Bcl-2的表达情况。统计学方法所有实验均重复3次后,数据以x±s表示,应用SPSS17.0软件处理数据,多组间均数比较采用单因设计资料的方差分析,两组均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果从蛋白芯片的结果可以看出,Survivin、HSP60、SMAC、HTRA、Bcl-2、p21、Fas等蛋白表达水平与单药和对照组相比均有不同程度的升高；而XIAP、CD40L、 CD40、bax等的表达与对照和单药相比均有不同程度的降低。Western印迹结果显示ITC与DNR可使Shh和Gli1的表达水平明显下降,并且下调凋亡相关蛋白Bcl-2、XIAP、SMAC的表达。结论1、ITC可以抑制Shh信号通路,与DNR联合后可明显的抑制Shh信号通路,以及改变凋亡相关蛋白表达。2、Bcl-2抑制剂ABT-199可诱导DNR+ITC联合作用于KGla细胞后存活的细胞凋亡,并明显的下调存活细胞Bcl-2表达。