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蛋白酶是一类具有高度特异性和高效催化能力并由细胞产生的生物大分子,广泛应用于临床医药和生产生活中。长久以来,一直认为蛋白质是酶的唯一来源。直到1978年核酶（Ribozyme）和1994年脱氧核酶（DNAzyme）的发现,它们分别是具有催化功能的RNA和DNA。其中DNAzyme性质稳定,广泛应用于分析化学、生物医学及纳米科学等领域。了解酶（蛋白酶或DNAzyme）的结构类型、折叠方式、活性中心组成,可获得相应酶的结构与功能之间的关系。对酶进行分子改造,将突变酶和野生酶结构进行比较,可获得相应的分子机制。同时,能高效快速地获得满足应用领域特定需求的高效稳定的酶。这对于进一步推动相关学科领域的深入研究具有重要科学意义。本文主要围绕海洋节杆菌右旋糖酐酶（蛋白酶）结构和相关功能性质展开研究。另外,鉴于脱氧核酶GR5 DNAzyme在海洋系统Pb2+生物传感的巨大应用潜力,本文对其结构功能和生化性质进行了探讨。主要内容如下:课题组成功筛选到一株来自海洋并具有较强的产右旋糖酐酶的菌株一Arthrobacter oxidans KQ11。在第二章中,测定了 A.oxidans KQ11全基因组,并对其进行了生物信息学分析。A.oxidans KQ11基因组总长度为4,811,453 bp,共编码4,563个基因,编码基因总长度为4,183,365 bp。基因组包含1条染色体和3个质粒。确定了两个 GH49 右旋糖酐酶（EC3.2.1.11）基因（KQ11GM001677 和 KQ11GM001683）,其中KQ11GM001683（简称KQ-N）基因用于构建产右旋糖酐酶工程菌。由于天然菌株产右旋糖酐酶的能力较低,想得到高纯度右旋糖酐酶困难很大,因此构建高产且易于纯化的右旋糖酐酶重组菌株显得尤为重要。在第三章中,将编码右旋糖酐酶基因KQ-N与质粒pColdⅢ重组表达,得到了高效表达右旋糖酐酶的重组菌株Escherichia coli BL21（DE3）1-5-pColdⅢ,纯化后的右旋糖酐酶比活力为294.43 U/mg,纯化倍数为34倍,获得高纯度的蛋白浓度为0.1717 mg/mL,为下一步右旋糖酐酶晶体制备提供了重要原料。天然酶的稳定性差、易失活,在工业生产的热处理条件下耐受性差,这严重制约酶的产业化应用。寻找和开发高活力、高热稳定性的右旋糖酐酶具有重要意义。如果明确右旋糖酐酶的结构和功能以及热稳定性的分子机制,则可以利用蛋白质（酶）进化工程,通过分子改造,提高右旋糖酐酶的热稳定性,以满足制糖等工业需要。在第四章中,利用来自工程菌E.coli BL21（DE3）1-5-pColdⅢ的高纯度右旋糖酐酶,在1.4?衍射分辨率下制备了海洋节杆菌右旋糖酐酶晶体（Aodex）,PDB（Protein Data Bank）编码:6NZS。Aodex包含2个结构域,其中N端N结构域为β三明治结构;C端C结构域为右手螺旋结构。Aodex的催化机制为反转型催化机制,Asp439为催化酸,Asp420为催化碱。基于B-factor半理性设计的突变体S357F热稳定性较Aodex有了明显提高,这得益于“苯-苯”作用力的形成。这为“基于B-factor半理性设计‘苯-苯’作用力提高酶稳定性”研究方法的推广和应用奠定重要基础。纳米层状双氢氧化物（LDHs）因其在聚合物纳米复合材料、制药、传感器等方面的应用前景而备受关注。在第五章中,阐明了 Mg-Fe-LDHNPs对海洋细菌A.oxidans KQ11产Aodex的作用机制。Mg-Fe-LDH NPs在提高Aodex产量的同时并不影响菌株生长。Mg-Fe-LDH NPs在10μg/L-100 mg/L已知浓度范围内,A.oxidans KQ11呈U型产Aodex趋势。研究发现,Mg-Fe-LDH NPs在促进Aodex表达的同时,还可吸附Aodex;A.oxidans KQ11在Mg-Fe-LDH NP作用下产生新的Shine-Dalgarno序列（GGGAG）和sRNAs,共同参与Aodex表达。研究发现,与铁代谢功能相关的转录产物表达显著增加。这一研究将为利用Mg-Fe-LDH NPs提高Aodex产量提供重要信息,甚至于可将其应用于提高其它海洋微生物来源的活性物质产量。此外,鉴于经典脱氧核酶（GR5 DNAzyme）在海洋系统Pb2+生物传感的巨大应用潜力,基于前期研究,在第六章和第七章中系统地研究了经典DNAzyme GR5的结构功能以及相关生化特性。在第六章中,将GR5逐步地进化为1 7E DNAzyme。由于GR5和17E耐受突变,研究中利用Pb2+/Mg2+活性速率比重新定义了 GR5和17E,GR5的Pb2+/Mg2+活性速率比约为17E的10,000倍。GR5的最终突变体相比于17E仅相差一个或两个核苷酸,最后,17E的T12被鉴定为影响Mg2+选择性的关键核苷酸。这项工作将经典GR5 DNAzyme与另一个经典的17E DNAzyme联系在一起,首次证明这两个DNAzyme具有同源性。这一研究成果将有助于该领域进一步了解DNAzyme的金属结合性和催化性,为生物传感器的开发和刺激响应材料的设计奠定重要基础。此外,DNAzyme的活性会受到溶液条件的显著影响,为了满足应用需求,需要仔细理解和控制这些影响因素来提高传感器的稳定性。目前关于pH的研究较多,而对盐和缓冲液种类的影响研究较少。我们认为阳离子和阴离子都可能影响DNAzyme的活性。GR5是首次报道的具有RNA切割活性的DNAzyme,因此本研究选用GR5作为研究对象。在第七章中,证明了 GR5是一个最优序列。阳离子选用Mg2+和Na+测试对Pb2+活性的影响,二者均能抑制GR5对Pb2+的活性,抑制常数分别为1.8 mM和33.4 mM。阴离子（F-、Cl-、Br-）也能抑制Pb2+对GR5的活性,F-、Br-的抑制作用强于Cl-,这是由于其溶解性和金属螯合作用所致。因此,需要控制离子强度和盐种类,以达到稳定的反应和传感。最后,研究了缓冲液的影响,发现大多数缓冲液都能起到促进酶活的作用。在pH 7.5的缓冲液中,长时间预处理的Pb2+与新制备的Pb2+产生相似的结果,但是磷酸盐缓冲液完全抑制了切割活性,需要避免使用。综合来讲,我们成功的得到了 Aodex的晶体结构（PDB编码:6NZS）,并阐释了催化及稳定性等相应的功能。基于半理性设计成功得到了热稳定提高的S357F。阐明了 Mg-Fe-LDHNPs调节海洋细菌A.oxidans KQ11产Aodex的作用机制。另一方面,系统的研究了 GR5 DNAzyme的结构功能以及相关特性。这项研究不仅加深了我们对蛋白酶和脱氧核酶的结构和功能的深入认识,同时也提供了研究两种不同类型酶的重要手段,为其各自在相关领域的应用奠定重要基础。