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【研究背景及目的】卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,占妇科恶性肿瘤的20%~30%,死亡率却在妇科肿瘤中最高。参与卵巢癌发生发展的信号途径非常多,其中最主要的一条途径是磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号途径。AKT处于该通路的中心地位,它既能够被多条通路所激活,又能调控下游的相关的分子,在多条与恶性肿瘤相关的通路中起重要的作用。AKT分子共分为3种亚型,AKT1/2/3。其中,AKT2与癌细胞侵袭,转移和生存最相关。在癌细胞中丙酮酸激酶M2(PKM2)存在过表达,导致葡萄糖摄取增加,糖酵解代谢物积累以及细胞代谢重编程,促进癌细胞生长和存活。PKM2除了具有调控肿瘤代谢的功能以外,还可以作为蛋白激酶、转录共激活剂等与细胞内分子相互作用,调控基因的转录,并与癌细胞抵抗凋亡以及其他促进癌症发生发展的非代谢的作用密切相关。我们前期通过免疫组化发现,卵巢癌与癌旁正常组织相比常过表达AKT2、PKM2,且两者具有统计学正相关性(P<0.05)。我们还通过免疫共沉淀、质谱鉴定技术、以及免疫荧光等实验发现PKM2是未曾报道过的AKT2的下游底物。有关PKM2在卵巢癌中的作用研究,国内外少有报道,尚不确定其具体功能。本项目首先拟探究PKM2是否在卵巢癌发生发展中起作用,接着探索AKT2通过PKM2调控卵巢癌细胞凋亡、转移和侵袭的的分子机制。【研究方法】选择SKOV3、HEY卵巢癌细胞作为研究对象,首先利用慢病毒转导和siRNA敲减技术,上调或下调PKM2,观察其对卵巢癌细胞生物学功能的影响。再通过AKT2和PKM2慢病毒表达载体分别转导卵巢癌细胞使其分别过表达AKT2及PKM2后,再利用shPKM2及shAKT2分别转染,建立AKT2过表达稳定敲减PKM2以及PKM2过表达稳定敲减AKT2的卵巢癌细胞株,观察不同因素处理对卵巢癌细胞生物学功能的影响,接着使用PI3K信号途径激活剂EGF、抑制剂LY294002以及mTOR抑制剂Rapamycin处理细胞,观察其对PKM2表达的影响。再利用Western-Blot法检测不同处理后下游分子(NF-κB、Bcl-XL、H3组蛋白、STAT3)的表达变化。最后使用构建好的卵巢癌SKOV3各组细胞,通过尾静脉注射雌Babl/c裸鼠观察肺转移结节数以及Western-Blot检测各组结节中相关分子的表达情况。【研究结果】1.CCK-8及克隆形成实验结果显示,与对照组相比,过表达PKM2能够提高卵巢癌细胞的增殖能力,siPKM2干扰敲减能够抑制卵巢癌细胞的增殖;2.流式细胞周期结果显示,与对照组相比,PKM2能够促进卵巢癌细胞周期G1期向S期转变,干扰PKM2能够阻滞卵巢癌细胞在G1/S期;3.流式细胞凋亡结果显示,过表达PKM2能够提高卵巢癌细胞抗血清饥饿诱发的细胞凋亡能力,敲减PKM2降低卵巢癌细胞抗血清饥饿诱发的细胞凋亡能力。提示在卵巢癌细胞中PKM2也具有抑制细胞凋亡的作用;4.Western-Blot结果显示,在卵巢癌细胞中过表达PKM2能够提高CCND1的表达,降低了CDKN1A的表达;敲减PKM2降低CCND1的表达,提高了CDKN1A的表达;5.与人永生化卵巢癌上皮细胞系HOSEpiC相比,人卵巢癌细胞系A2780、CAOV-3、COC1、HEY、HO8910、OVCAR3和SKOV3均高表达AKT2(P<0.05);6.siRNA干扰AKT2会下调PKM2表达量。AKT1、AKT3表达量变化并不影响PKM2蛋白表达量;7.成功构建AKT2过表达后稳定敲减PKM2、PKM2过表达后稳定敲减AKT2的卵巢癌细胞系;8.过表达AKT2上调卵巢癌细胞中PKM2的表达量;干扰PKM2不会抑制AKT2过表达卵巢癌细胞中的AKT2表达水平;沉默AKT2抑制过表达PKM2卵巢癌细胞中的PKM2表达水平;9.干扰AKT2抑制PKM2介导的卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力;10.干扰AKT2抑制PKM2介导的卵巢癌细胞的抗血清饥饿诱导的凋亡能力;11.卵巢癌细胞中AKT2上游分子PI3K及AKT2下游分子mTOR调控PKM2的表达。12.干扰AKT2抑制PKM2介导的卵巢癌细胞在裸鼠体内的肺转移结节数量及转移灶面积。13.Western-Blot检测发现,mTOR,STAT3和NF-κB可能是促进卵巢癌进展的AKT2/PKM2途径的下游分子靶标。特别是STAT3和NF-κB可能作为PKM2的下游分子靶点。【结论】1.PKM2能够提高卵巢癌细胞的增殖能力;PKM2能够促进卵巢癌细胞周期G1期向S期转变;PKM2能够提高卵巢癌细胞抗血清饥饿诱导的细胞凋亡能力,在卵巢癌细胞中PKM2能够间接或直接调控CCND1和CDKN1A的表达;2.人卵巢癌细胞系常高表达AKT2;AKT2是PKM2的上游分子。体外实验发现,AKT2通过PKM2调控卵巢癌细胞侵袭和转移以及抵抗血清饥饿诱导的凋亡能力。AKT2上游分子PI3K及下游分子mTOR均可调控PKM2的表达。体内实验发现,AKT2通过PKM2调控卵巢癌细胞在裸鼠体内的肺转移结节数量及转移灶面积。mTOR,STAT3和NF-κB可能是促进卵巢癌进展的AKT2/PKM2途径的下游分子靶标。特别是STAT3和NF-κB可能作为PKM2的下游分子靶点。