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流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,具有很强的传染性。每年的季节性和周期性的流感大流行,严重危害人类健康,在世界范围内造成巨大的经济损失和人员的死亡。流感病毒属于正粘病毒科的负链RNA病毒,流感病毒基因组的特点,决定了其不断发生抗原漂移和抗原转换,使得新的流行株不断出现。1997年开始出现感染人的H5N1亚型高致病性禽流感病毒。随后,在世界各地又不断出现H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染人的报道,使得防控H5N1亚型高致病性禽流感病毒在公共卫生体系中的意义愈发凸显。一旦病毒变异导致在人群中的迅速传播,很可能会造成世界性流感大流行。目前防控流感最有效的措施仍为疫苗接种,而基于鸡胚传代的传统疫苗生产能力有限。同时,H5N1亚型流感病毒毒性极强,不适合用鸡胚传代。所以研制有效并且易于制备的新型流感疫苗迫在眉睫。DNA疫苗、腺病毒载体疫苗以及流感病毒VLPs疫苗就是其中比较有发展前景的流感疫苗策略。另外,传统的流感疫苗主要抗原成份为容易发生变异的HA和NA,不能产生对多种流感病毒的保护作用,需要根据流行毒株的变化经常更换生产疫苗用的毒株。M2蛋白在甲型流感病毒的不同亚型中高度保守,因此利用M2蛋白研制流感通用疫苗也成为热点。本研究以我国人感染病例中分离到的、WHO推荐的Clade2.3.4疫苗候选株A/Anhui/1/2005(H5N1)为研究对象,克隆了全部四种膜蛋白基因HA、NA、M1、M2的完整开放读码框。以这四种膜蛋白基因为目的基因,构建了表达单基因或表达双基因的重组DNA疫苗和重组腺病毒载体疫苗。通过DNA疫苗与腺病毒载体疫苗联合免疫BALB/c小鼠,对单种膜蛋白基因免疫及多种组合的两种膜蛋白基因共免疫效果进行了评价。本研究包括四个部分:1.含流感病毒膜蛋白基因的重组DNA疫苗的构建及鉴定通过PCR扩增得到H5N1亚型流感病毒(A/Anhui/1/2005)的四种膜蛋白基因M1、M2、NA、HA,并经DNA测序确证。应用含有IRES序列的双基因共表达pStar载体,成功构建了7种单基因重组pStar载体:pStar-M1/、pStar-/M1、pStar-M2/、pStar-/M2、pStar-NA/、pStar-/NA以及pStar-/HA。用脂质体法将其分别转染293细胞,应用免疫荧光法检测到了目的基因的表达。进而根据不同的两种膜蛋白基因组合方式,构建了7种双基因共表达重组pStar载体:pStar-M1/M2、pStar-M1/NA、pStar-M1/HA、pStar-M2/M1、pStar-M2/NA、pStar-M2/HA以及pStar-NA/M2。用脂质体法将其分别转染293细胞,应用免疫荧光法检测到了各载体的双基因共表达。2.含流感病毒膜蛋白基因的重组腺病毒载体疫苗的构建及鉴定应用Ad-Easy腺病毒载体系统,采用同源重组、293细胞包装的方法,成功构建并包装出含单基因的重组腺病毒Ad-M1、Ad-M2、Ad-NA、Ad-HA。感染293细胞后,用免疫荧光法检测到了各重组腺病毒目的基因的表达。同时构建并包装出不含外源基因的对照腺病毒Ad-easy。此外,还以pStar-M1/HA为模板,扩增出M1-IRES-HA片段,构建并包装出M1、HA双基因共表达的重组腺病毒Ad-M1/HA。感染293细胞后,用免疫荧光法及Western-blot法检测到了M1和HA基因的共表达。3.重组DNA疫苗及腺病毒载体疫苗体内免疫效果研究将含有流感病毒膜蛋白基因的重组DNA疫苗与腺病毒载体疫苗以肌肉注射的方式联合免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠,共免疫四次,每次间隔14d。第一、三次免疫用DNA疫苗,免疫剂量为100μg/小鼠。第二、四次免疫用重组腺病毒载体疫苗,免疫剂量为2.5×10~8TCID50/小鼠。根据所注射疫苗含有的基因情况将小鼠分为5组:一个单基因免疫组(HA)、三个双基因共免疫组(M1HA、M2HA、M2M1)和一个空载体免疫对照组(NC)。每次免疫前采集血清,末次免疫后14d采集血清和脾淋巴细胞用于检测体液免疫和细胞免疫应答。血凝抑制实验结果表明,含有HA基因的HA、M1HA、M2HA免疫组小鼠血清中均检测到了红细胞凝集抑制活性。ELISA实验检测到了HA、M1HA、M2HA免疫组小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体,还检测到了M1HA和M2M1免疫组小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒M1蛋白的IgG抗体。使用小鼠脾淋巴细胞应用ELISPOT实验分别对H5N1亚型流感病毒HA蛋白肽库(77条多肽)、M1蛋白肽库(31条多肽)、M2蛋白肽库(11条多肽)进行了筛选,确定了HA、M1、M2蛋白肽库中具有刺激相应免疫组小鼠脾细胞产生IFN-γ能力的多肽,表明各免疫组成功地刺激了宿主针对相应抗原的特异性细胞免疫应答。上述实验结果还表明,M2M1、M1HA及M2HA三个双基因共免疫组小鼠成功刺激出了针对两种抗原的免疫反应。同HA单基因免疫组相比,M1HA及M2HA双基因共免疫组刺激产生的针对HA蛋白的体液和细胞免疫应答水平没有减弱,表明在双基因共表达载体中下游基因的低表达水平并未影响其免疫效果。结果提示,相对于单基因免疫,双基因共免疫有可能提供更理想的免疫保护效果。4.含M2基因疫苗对流感病毒PR8株攻击的保护作用研究以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株对含有M2基因的重组DNA疫苗与腺病毒载体疫苗联合免疫后的小鼠于末次免疫后14d进行病毒攻击。病毒攻击后14d内,逐日观察小鼠的生存及体重变化情况。结果表明,小鼠经含H5N1亚型流感病毒M2基因的疫苗免疫后对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株滴鼻攻击具有一定的交叉保护效果。综上所述,本论文以H5N1亚型流感病毒A/Anhui/1/2005株作为研究对象,克隆了M1、M2、NA、HA基因的全长开放读码框,构建了含单个基因或双基因共表达的多种重组pStar载体和重组腺病毒载体。这些载体的构建,为进一步研究新型流感疫苗奠定了基础。将重组DNA疫苗与重组腺病毒载体疫苗联合免疫小鼠,单基因免疫及多种组合的双基因共免疫均刺激产生了较好的体液免疫和细胞免疫应答。病毒攻击实验初步表明含H5N1 M2基因的疫苗对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株滴鼻攻击具有一定的交叉保护效果。本论文为研制新型H5N1流感疫苗提供了新的思路和方法。