目的:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种革兰阴性非发酵菌,是临床常见的条件致病菌,可以引起呼吸道、泌尿道、皮肤、腹腔和血液等多个部位的感染。且PA在抗生素的影响下可以通过突变等机制产生获得性耐药,使临床治疗面临极大的困境。而质粒介导的耐药基因水平转移是PA产生耐药性的重要机制。细菌在生长过程中向周围释放特定的信号分子,以感知菌群密度变化,当信号分子随着细菌密度增加而积累到一定浓度,达到特定阈值时,信号分子会与受体蛋白相结合,使受体蛋白构象或基团发生变化,启动一系列基因表达,进而调节细菌的群体行为,这种现象被称为群体感应(Quorum sensing,QS)。在革兰阴性杆菌中存在以酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactone,AHL)类物质作为信号分子的QS系统,AHL可以与细菌的LuxR类蛋白受体结合,实现对下游一系列基因的调控。有些细菌例如大肠埃希菌、霍乱弧菌等基因组内不含有QS系统,不能产生AHL类信号分子,但是却表达LuxR类蛋白同源分子—SdiA蛋白,可以与周围环境中的AHL结合,同时SdiA也是转录因子,可以通过SdiA box与基因启动子结合,调控基因的表达。接合(Conjugation)是细菌以性菌毛为桥梁进行基因水平转移(horizontal gene transfer,HGT)的过程,是由质粒介导耐药基因传播的主要机制。传统观念认为,接合主要由质粒携带的接合性元件调控。本课题组前期通过构建大肠埃希菌-铜绿假单胞菌接合模型,研究受体菌PA在接合调控中的作用,发现PA QS系统的信号分子AHL具有抑制质粒接合性转移的重要作用。本部分实验利用同样的接合模型,观察在抗生素干预下接合效率的变化,以及QS系统关键基因lasI、rhlI,接合关键基因traI的表达水平的变化,并以细菌非编码小RNA为切入点探讨在抗生素干预下接合表型及相关基因产生变化的具体机制。方法:本实验构建的接合模型是以SM10λπ作为供体菌。该菌的染色体上整合了接合性质粒RP4(含有基因traI),且菌体内含有重组质粒pUCP24T,该质粒是由本实验室构建,以质粒pUCP24为骨架,通过基因重组的方法,插入质粒pCVD442基因组内控制接合反应的起始序列oriT片段,该片段含有松弛酶识别位点,是决定质粒能否进行接合转移的关键,质粒pUCP24T含有庆大霉素(Gm)抗性基因,可以作为接合子筛选的标记。此外有以SM10λπsdiA基因敲除株SM10λπΔsdiA作为供体菌的接合模型,蛋白sdiA是大肠埃希菌内QS系统信号分子的受体蛋白,AHL与SdiA结合后,可以通过sdiA box抑制接合相关基因traI的表达。本实验使用SM10λπΔsdiA突变株,可以排除受体菌所分泌的信号分子对供体菌以及接合效率的影响。本实验受体菌选用铜绿假单胞菌野生株PAO1,以及其lasI、rhlI基因敲除株PAO1ΔrhlI、PAO1ΔlasI,其中rhlI、lasI基因分别调控QS系统信号分子C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的合成和分泌,且PAO1对于氨苄西林(APM)天然耐药,只有获得质粒pUCP24T的接合子才同时具有Gm和APM抗性,才能在Gm+APM筛选平板上生长。为了观察在没有QS系统的情况下,抗生素对于接合效率的影响,本实验以同为大肠埃希菌的SM10λπ、EC600分别作为供体菌和受体菌,利用EC600对于利福平(RIF)天然耐药的特性,选用Gm+RIF抗性平板筛选接合子。分别将供体、受体菌培养至对数生长期,使用全自动尿液分析仪测量菌液浓度,按照1:1比例将供、受体菌混合,使其终浓度为1.0×10~7CFU/mL,取200μL混合菌液,37℃,共培养6h。用抗生素平板筛选接合子并计数,计算其接合效率。收集共培养后的混合菌液,提取RNA并逆转录为cDNA,以cDNA作为模板,使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测QS系统关键基因lasI、rhlI以及接合相关基因tarI的相对表达量。PA基因组不含有tarI基因,而大肠埃希菌基因组没有QS系统,因此使用两种菌的混合菌液提取的全RNA组,不会对qPCR的结果产生影响。利用生物信息学软件IntaRNA对PA中已注释过的sRNA进行靶基因预测,筛选QS系统相关sRNA,qPCR检测筛选到的候选sRNA与QS系统关键基因的相互关系。通过无痕同源重组的方法敲除铜绿假单胞菌PAO1株的prrH基因。利用PCR扩增prrH基因上下游同源臂片段,连接到载体pGSM(含有庆大霉素抗性基因aacC1片段、蔗糖敏感基因sacB片段以及接合转移基因mob片段)上,构建质粒pGSM-PrrHAB,并转化入大肠埃希菌SM10λπ感受态细胞。后者通过接合反应将质粒转移到PAO1株,利用抗生素选择压力实现同源重组,然后利用蔗糖选择压力去除抗性筛选标记。利用PCR、DNA测序等方法对突变株进行鉴定,最后测定突变株的生长曲线和生化反应。结果:在对受体菌造成生存压力的抗生素干预下,PAO1中lasI、rhlI基因表达显著下调,SM10λπ中traI表达上调,SM10λπ-PAO1接合频率增高10倍左右(P<0.01),通过敲除lasI/rhlI或sdiA阻断AHLs-SdiA-TraI信号通路可削弱抗生素诱导的接合。另一方面,对于SM10λπ-EC600接合体系,可能由于缺乏QS信号分子产生基因而无以上效应(P<0.01)。通过生物信息学分析发现QS系统多个关键基因如qscR、lasI、rhlI、rhlR等受到相关sRNA的潜在调控,并筛选出5条对QS系统具有潜在调控功能的sRNA,即PrrF、PrrH、CrcZ、RgsA、P34,其中sRNA PrrF和PrrH可能靶向LasI;RhlI及C4-HSL受体RhlR分别是sRNA RgsA、CrcZ或P34的潜在靶基因。成功构建了PAO1 prrH基因敲除株。结论:本实验以所构建的两种接合模型为基础,从表型和基因两个层面证明了抗生素胁迫可以使QS系统表达下调,通过降低对接合反应的抑制作用而促使细菌获得外源性耐药基因以适应环境。