论文部分内容阅读
背景:肝细胞癌是一种全球范围内严重影响人类健康的疾病。外科手术配合肝动脉栓塞化疗、分子靶向治疗、免疫治疗等多种综合治疗下,肝癌的疗效依然让人不满意,早期转移和术后复发是常见致死原因。肝癌的复发转移呈现出复杂的多因素进程,具有进展迅速、多个步骤、多种因素共同作用的特点。因此,寻找一个在肝癌复发转移过程中起着核心作用的基因,有利于研制出有效的药物,使患者的生存和预后得到改善。常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2,EHMT2),也称为G9a,它的重要特征是C端含有经典的SET结构域而且发挥着组蛋白甲基化转移酶(histone methylation transferase,HMT)活性,功能是蛋白的甲基化。G9a由两部分组成,较长部分的功能是把氨基酸序列完整的表达出来;较短部分的功能是识别甲基化位点。G9a表达水平在乳腺癌、骨髓癌、膀胱癌、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤中都明显升高。G9a在非小细胞肺癌组织中呈现高表达状态,在细胞水平上能够促进肺癌的侵袭和转移。G9a在子宫内膜癌中也表现出高表达状态而且促进肿瘤细胞浸润性生长,在细胞水平利用小干扰RNA(Small interfering RNA,Si RNA)沉默了G9a的表达后,体内和体外实验都表明肿瘤细胞的浸润和转移受到抑制。G9a在多种肿瘤中参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、转移等多个环节,是近年来表观遗传学研究的重点。但G9a在肝癌中研究很少,其在肝癌的进展和演化中的作用更是未见报道。目的:研究G9a在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况,大样本研究G9a与患者临床病理以及预后的联系;通过细胞实验和裸鼠实验两方面研究沉默G9a后肝癌细胞在细胞增殖能力以及迁移、侵袭能力的变化;研究G9a在肝癌转移中的可能机制。方法:应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组化检测肝细胞癌和相应癌旁组织中G9a的表达情况,应用免疫组化大样本研究G9a的表达情况与肝癌患者的临床病理以及患者预后的联系。运用慢病毒转染技术下调G9a在人肝细胞癌细胞系中的表达,观察体外细胞学实验和体内裸鼠实验中G9a在肝癌细胞中的作用。用PCR芯片筛选G9a可能作用的基因和靶点,用Western blot验证筛选出的基因,探索G9a在肝癌侵袭和转移中的机制。结果:第一部分:应用RT-qPCR对30例原发性肝癌组织和对应30例癌旁肝组织研究,实验结果表明:肝癌组织G9a m RNA水平平均值为2.34±1.00,而癌旁正常组织中G9a m RNA水平平均值为0.99土0.29,肝癌和癌旁组织比较表达明显差异(P<0.05)。用免疫组化研究了350例肝癌患者G9a的表达情况,实验结果表明:G9a表达阳性的有176例(50.3%),G9a的表达与肿瘤TNM分期、肿瘤大小相关(P<0.05),与性别、年龄等无关;Cox风险因素分析发现,肿瘤TNM分期、肿瘤大小和G9a表达水平能够作为监测肝癌患者预后的独立因素(P<0.05)。K-M生存时间曲线表明,和G9a阴性表达相比较,G9a阳性表达的肝癌患者生存时间明显缩短,具有统计学差别(P<0.05)。G9a表达阳性的患者预后较差,G9a在预测肝癌患者预后方面具有临床价值。第二部分:应用RT-qPCR和Western blot研究5株人肝癌细胞系和1株人肝正常细胞系,我们发现5株肝癌细胞系中G9a均高表达,其中以HCCLM3和MHCC97H两株肝癌细胞系中G9a表达最高。干扰靶点Y2713、Y2714、Y2715对G9a的表达都有敲减效果。干扰靶点Y2714稳定株对HCCLM3、MHCC97H细胞G9a的表达有敲减效果,成功建立慢病毒稳定株。第三部分:体外细胞实验中,下调G9a后HCCLM3和MHCC97H细胞增殖能力、侵袭能力减弱;敲减G9a后HCCLM3细胞裸鼠成瘤能力弱,肿瘤体积明显变小,肿瘤生长减慢。第四部分:PCR芯片筛查结果显示,下调G9a后金属蛋白酶(MMPs)MMP2、MMP7、MMP9、MMP10表达降低,金属蛋白酶抑制剂TIMP3表达水平升高,CD44、VEGF等与血管浸润和转移相关的基因表达降低。Western blot证实下调G9a表达后H3K9me2随之下降;RT-qPCR和Western blot证实下调G9a表达后MMP2、MMP9、CD44V6、VEGF m RNA和蛋白表达水平呈现低表达状态,TIMP3表达水平升高。结论:G9a在肝癌中表达显著高于癌旁组织;G9a的表达与肿瘤TNM分期、肿瘤大小相关,并与肝癌预后负相关,在预测肝癌患者预后方面具有临床价值。体外细胞实验和体内裸鼠实验证实,G9a增强肝癌细胞活力并且与肝癌细胞迁移和侵袭能力正相关。G9a可能通过特定的分子信号通路增强MMP2、MMP9、CD44v6、VEGF的表达影响肝癌细胞的增殖能力、侵袭转移能力等恶性生物学行为。