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目的:围产期缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic Ischemic Brain Damage,HIBD)是常见引起儿童严重神经系统后遗症的主要原因之一,给家庭和社会带来沉重负担。本实验模拟人类新生儿常见急性宫内缺氧病因,建立围生期兔HIBD模型,进一步研究PI3K/Akt信号通路是否参与新生兔HIBD机制,为HIBD提供科学的治疗靶点。方法:1.围产期兔HIBD模型的建立采用手术栓塞腹主动脉间接阻断孕兔子宫动脉血供的方法,建立围生期兔缺氧缺血脑损伤模型。选取健康的新西兰孕兔(孕29天,约占92.06%孕期)。麻醉成功后无菌手术,将4F Fogarty动脉导管插入动脉,并顺畅进入约10cm,此时球囊的位置正好在肾动脉开口下端和子宫动脉上端之间。注入0.3ml生理盐水以扩张球囊,阻断子宫血供。阻断开始到结束计时25分钟,回抽生理盐水,撤回导管,永久结扎动脉近端,逐层缝合关闭皮肤。24小时后孕兔一般情况良好情况下剖宫产取出幼兔,立即对新生兔进行一般情况记录、神经行为检查,测定血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平和脑组织含水量,使用免疫组织化学法观察海马CA1区裂解Caspase-3阳性细胞水平。2.在确立新生兔HIBD模型建立成功基础上,进一步研究PI3K/Akt信号通路是否参与HIBD的发病机制。将32只孕兔严格依照统计学上随机数字表的随机性原则,将其分成4组,每组8只,分别为Sham组(假手术组)、HIBD组(缺氧缺血组)、DMSO组(二甲基亚砜溶剂组)、LY294002组(PI3K/Akt通路抑制剂组)。假手术组只做股动脉结扎处理。DMSO组和LY294002抑制剂组分别为宫内缺氧后即刻通过孕兔耳缘静脉推注DMSO溶剂2ml或LY294002(6.4μg/Kg,由DMSO溶剂定容为2ml)。应用荧光定量PCR和Western Blot法检测PI3K/Akt信号途径相关蛋白和凋亡基因表达。采用SPSS22.0软件进行上述各组相关指标的统计分析。结果:1.成功建立围生期兔HIBD模型,适用于缺氧急性期神经信号传导机制研究。在新生家兔中,HIBD与Sham组相比,(1)各项神经学评分降低:姿势评分(1.62±0.51∝2.75±0.46,P<0.05)、翻正反射评分(1.50±0.54∝2.75±0.46,P<0.05)、吸吮吞咽反射评分(1.35±0.71∝2.75±0.46,P<0.05);(2)血清NSE水平(1.28±0.18pg/L∝0.32±0.13pg/L,P<0.05);(3)脑含水量(89.52±0.15%∝88.18±0.22%,P<0.05)升高;(4)脑组织病理示:HIBD组细胞数量减少,细胞核染色不均匀,核固缩;海马CA1区裂解caspase‐3阳性细胞增多。(5)HIBD组新生兔在生后24小时内死亡率较高,幸存新生兔在生后3天时姿势、翻正反射次数、翻正反射评分(分别为:2.63±0.50,9.00±1.41,2.63±0.50)仍低于Sham组(all P<0.05),生后7天时仅体重低于Sham组(66.27±9.2g∝86.00±13.94g,t=5.309,P<0.05),神经行为反射已完全恢复正常。2.PI3K/Akt信号通路参与了新生兔HIBD及其发病机制本实验研究结果表明:缺氧缺血抑制PI3K/Akt信号通路,HIBD组与Sham组相比PI3K的蛋白质水平(0.68±0.07 pg/L∝1.28±0.08 pg/L,P<0.05)和Akt磷酸化程度(0.50±0.06%∝0.85±0.07%,P<0.05)降低;Bcl-2 m RNA表达减少(0.72±0.05 pg/L∝1.10±0.02 pg/L,P<0.05),BAD和Bax m RNA表达增加(分别为1.59±0.08 pg/L∝1.00±0.03 pg/L;1.48±0.07 pg/L∝1.05±0.02 pg/L,均P<0.05),Akt、BAD磷酸化程度降低(分别为0.50±0.06∝0.85±0.07%,0.42±0.05∝0.78±0.06,均P<0.05)。3.调控PI3K/Akt信号通路可修复新生兔HIBD神经损伤的及其机制本实验研究结果显示:(1)LY294002组与HIBD组相比进一步增加了胎儿死亡率(35.4%∝12.30%,P<0.05);(2)LY294002降低缺氧后新生兔的神经行为评分,与HIBD组相比,姿态评分(0.88±0.24∝1.62±0.51,P<0.05)、翻正反射评分(0.75±0.07∝1.50±0.54,P<0.05)、吞咽反射评分(0.75±0.07∝1.35±0.71,P<0.05)均减低;(3)LY294002组与HIBD组相比,NSE(1.75±0.14 pg/L∝1.28±0.18 pg/L,P<0.05)和脑含水量(89.92±0.28%∝89.52±0.15,P<0.05)增加;(4)脑组织病理学显示LY294002组海马区脑损伤程度加重,细胞数量明显减少;LY294002组与HIBD组相比,可增加HIBD裂解Caspase-3阳性细胞表达(27.54±2.68%∝20.61±2.16%,P<0.05);增强神经元对HIBD的凋亡反应(AI:36.48±1.43∝32.56±2.08,P<0.05);(5)LY294002组与HIBD组相比,Bcl-2 m RNA的表达(0.44±0.03 pg/L∝0.72±0.05 pg/L,P<0.05),增加Bad和Bax m RNA的表达(分别为1.92±0.09pg/L∝1.59±0.08pg/L,1.86±0.06pg/L∝1.48±0.07pg/L,P<0.05)。LY294002组p-BAD/t-BAD和Bcl-2/Bax蛋白水平比值均低于HIBD组(分别为0.28±0.02∝0.42±0.05,0.41±0.04∝0.74±0.07,P<0.05)。结论:1.围生期兔HIBD的模型成功建立,可作为新生儿HIBD早期分子机制和干预方法的研究。2.本研究发现缺氧抑制了PI3K/Akt信号通路的活化,证明该通路参与了新生兔HIBD发病机制。3.PI3K/Akt信号可减少HIBD神经元凋亡发挥神经保护作用。PI3K/Akt信号通路可作为修复神经功能损伤的治疗靶点之一。