背景心力衰竭是心血管疾病患者的首要死亡原因。临床上由高血压和瓣膜病等压力负荷增加所致的心肌纤维化是促使患者心功能从代偿发展至失代偿,从而导致心力衰竭的主要危险因素。然而,其发生机制尚未阐明。心脏压力过负荷可以使心肌组织中的心肌细胞和心肌成纤维细胞等所承受的机械过度牵张力明显增加,进而通过直接作用和心肌组织各细胞之间信号传递的旁分泌机制诱导心肌成纤维细胞活化,导致心肌纤维化和心功能障碍。尤其是,心肌细胞的旁分泌作用是影响心肌纤维化发生发展的关键因素,但心肌细胞旁分泌及其与心肌成纤维细胞之间信息传递的分子机制尚未阐明。外泌体可以作为一种具有生物活性的细胞间转运载体,可通过其携带的DNA,m RNA,micro RNA（miRNA）,long noncoding RNA（Lnc RNA）和蛋白等介导细胞间的信息传递。已有文献报道,心肌细胞miR-378、心肌细胞外泌体中的miR-208a在调控心肌成纤维细胞活化中具有重要作用,提示心肌细胞可通过其分泌的外泌体携带的miRNA介导其对心肌成纤维细胞活化的调控。然而,在心脏压力过负荷所致心肌细胞机械过度牵张过度时,心肌细胞外泌体携带miRNA会发生怎样的变化?心肌细胞是否可以通过外泌体miRNAs变化介导其对心肌成纤维细胞的旁分泌调控作用?机械过度牵张刺激心肌细胞,导致其外泌体miRNAs发生变化的信号调控机制是什么?这些科学问题,目前尚未阐明。我们和其他学者的报道均表明,Toll样受体/白介素-1受体（Toll-like receptor/Interleukin-1 receptor,TLRs/IL-1R）介导的细胞内信号转导在压力过负荷诱导的心肌肥大及心肌纤维化的发生发展中发挥重要的调控作用。Pellino1（Peli1）蛋白是TLRs/IL-1R信号通路中的一个重要调节分子,我们的前期研究发现,心肌条件性敲除Peli1可以改善心梗后心肌组织纤维化和胶原沉积,提示心肌细胞Peli1参与了心梗后心肌纤维化的发展进程。在上述研究基础上,推测心肌细胞Peli1可能通过旁分泌调控了心肌成纤维细胞活化,进而影响心肌纤维化的发展进程。为此,本论文拟采用整体动物与体外细胞两个方面有机结合的研究方法,明确Peli1是否可以通过调控心肌细胞外泌体介导其对心肌成纤维细胞活化和压力过负荷所致心肌纤维化的调控作用,阐明Peli1对心肌细胞外泌体miRNA含量变化的调控作用,揭示机械过度牵张刺激心肌细胞导致其外泌体携带的何种miRNAs变化在介导心肌细胞对心肌成纤维细胞的旁分泌调控中发挥关键作用,并进一步阐明这种关键miRNAs变化影响心肌成纤维细胞活化的信号调控机制。目的明确Peli1是否可通过心肌细胞外泌体旁分泌机制调控心肌成纤维细胞活化及压力过负荷所致心肌纤维化的发展进程;并阐释其调控心肌纤维化的分子机制是否与Peli1通过心肌细胞外泌体miR-494-3p介导其对心肌成纤维细胞活化的作用密切相关;为探究心肌纤维化及心力衰竭的防治提供新的线索。方法与检测指标1.体外细胞实验培养Wild type（WT）与Peli1全身性敲除(Peli1-/-)小鼠心肌细胞、WT心肌成纤维细胞,以15%的机械过度牵张应力牵拉心肌细胞24小时复制心肌细胞肥大模型。首先,证实Peli1通过心肌细胞外泌体调控心肌成纤维细胞活化的旁分泌作用。采用心肌细胞条件培养基刺激心肌成纤维细胞,q RT-PCR检测心肌成纤维细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA水平。通过透射电镜、纳米粒子示踪仪、Western blot、免疫荧光鉴定心肌细胞外泌体;PKH67标记心肌细胞外泌体,共聚焦显微镜下观察心肌成纤维细胞摄取心肌细胞外泌体情况。通过Ed U染色反映机械过度牵张刺激心肌细胞来源的外泌体（MS-Exos）诱导心肌成纤维细胞增殖的情况;通过Western blot检测α-SMA表达评价MS-Exos对心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的作用;通过q RT-PCR检测MS-Exos对心肌成纤维细胞α-SMA,Ⅰ/Ⅲ型胶原及结缔组织生长因子m RNA水平变化的影响。其次,筛选并明确心肌细胞外泌体中的关键miRNAs-miR-494-3p对心肌成纤维细胞活化的调控作用。通过miRNA microarray及q RT-PCR筛选并鉴定,在机械过度牵张刺激下,心肌细胞外泌体中的关键miRNAs变化;在通过筛选初步确定心肌细胞外泌体miR-494-3p可能是心肌细胞旁分泌调控心肌成纤维细胞活化的重要因素基础上,进一步构建miR-494-3p mimics,通过Ed U染色、Western blot及q RT-PCR检测过表达miR-494-3p对心肌成纤维细胞活化的影响。第三,探索心肌细胞外泌体miR-494-3p介导心肌成纤维细胞活化的具体分子机制。通过报告基因实验,证明miR-494-3p对PTEN的直接作用。构建miR-494-3p mimics和inhibitors,以MS-Exos作为诱导因素,通过Western blot检测各组心肌成纤维细胞中PTEN表达及AKT（T308/S473）、Smad2（S465/467）、Smad3（S423/425）以及ERK（T202/Y204）上述位点磷酸化水平。2.整体动物实验构建心肌细胞条件性敲除Peli1小鼠(Cardiomyocytes-conditional knockout of Peli1 mice,Peli1cko)、同窝对照小鼠(Peli1Flox/Flox,Peli1F/F);C57BL/6小鼠尾静脉注射r AAV9-anti-miR-494-3p以特异性抑制心肌组织miR-494-3p表达,并设立相应的r AAV9-NC对照组;以主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）复制压力过负荷所致心肌纤维化模型。首先,证明Peli1对压力过负荷所致心肌纤维化发生发展的影响,采用Langendorff灌流系统,提取各组小鼠左心室心肌细胞,通过Western blot检测Peli1在压力过负荷所致各组小鼠心肌细胞中的表达情况;通过形态学观察心脏大小、计算小鼠心重/体重、心重/胫骨长、H＆E染色检测小鼠TAC所致心肌肥大严重程度;通过Masson染色检测心肌组织间质和血管周胶原沉积、q RT-PCR检测心肌组织中Ⅰ与Ⅲ型胶原和结缔组织生长因子m RNA表达水平、羟脯氨酸检测计算心肌组织总胶原含量,评估TAC所致心肌纤维化严重程度。其次,阐明心肌细胞外泌体中miR-494-3p对压力过负荷所致心肌纤维化和心功能障碍的影响并探索其具体的分子机制。采用r AAV9-anti-miR-494-3p特异性抑制心肌组织miR-494-3p表达进行小鼠在体实验。通过体式荧光显微镜观察GFP绿色荧光强度以及q RT-PCR检测心肌组织miR-494-3p m RNA水平的方法,鉴定r AAV9-anti-miR-494-3p或r AAV9-NC转染心肌组织的效率;通过形态学观察心脏大小、计算小鼠心重/体重、心重/胫骨长、H＆E染色检测心肌肥大严重程度;通过Masson染色、心肌组织中Ⅰ与Ⅲ型胶原和结缔组织生长因子m RNA表达水平的q RT-PCR检测、羟脯氨酸检测心肌组织总胶原含量,评估TAC所致心肌纤维化严重程度;超声心动图检测心功能变化;Western blot检测压力过负荷所致心肌组织中PTEN表达及AKT（T308/S473）、Smad2（S465/467）、Smad3（S423/425）以及ERK（T202/Y204）上述位点磷酸化水平。结果一、Peli1通过调控心肌细胞旁分泌促进压力过负荷所致心肌纤维化1.TAC可明显诱导Peli1F/F小鼠CMs中Peli1表达,心肌细胞条件性敲除(Peli1cko小鼠)可敲除CMs中的Peli1;同时,TAC可导致Peli1F/F小鼠心脏增大、HW/BW、HW/TL及LW/BW增加、心肌细胞横截面积增加（H＆E染色）、心肌间质和血管周的胶原沉积增加（Masson染色与天狼猩红染色）、心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原以及结缔组织生长因子m RNA表达水平显著增高、心肌组织中羟脯氨酸含量增加;而Peli1cko小鼠与Peli1F/F小鼠相比,则可以明显改善上述TAC所致的心肌肥大和心肌纤维化的变化。表明,心肌组织中Peli1表达与心脏压力过负荷所致的心肌肥大和心肌纤维化密切相关,心肌细胞条件性敲除Peli1可有效延缓压力过负荷所致的心肌肥大与纤维化。2.机械过度牵张刺激心肌细胞的条件培养基（MS-C）可导致心肌成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原m RNA表达水平明显增加,而心肌细胞Peli1敲除则可明显抑制MS-C所致的心肌成纤维细胞胶原合成增加。提示,机械过度牵张可以通过Peli1调控心肌细胞旁分泌影响心肌成纤维细胞活化。二、Peli1通过心肌细胞外泌体介导其对心肌成纤维细胞活化的旁分泌作用1.透射电镜显示MS-Exos呈杯状;纳米粒子示踪仪显示MS-Exos粒径大小在30-150nm之间;机械过度牵张心肌细胞来源的外泌体（MS-Exos）与未机械过度牵张心肌细胞来源的外泌体（Con-Exos）生物标志物（CD9、CD63、TSG101）表达,而阴性对照Calnexin在心肌细胞外泌体中未见表达;GW4869作为外泌体特异性抑制剂,可显著使心肌细胞内CD63聚集（免疫荧光）,表明GW4869可致MS-Exos分泌受阻等。上述结果提示提示,心肌细胞分泌的细胞外囊泡为外泌体。2.与阴性对照组相比,波形蛋白标记阳性的心肌成纤维细胞中可见较多的PKH67标记MS-Exos（免疫荧光）,证实心肌成纤维细胞可有效摄取心肌细胞分泌的外泌体;MS-Exos可显著导致心肌成纤维细胞中Ed U掺入（Ed U染色）增加、心肌成纤维细胞α-SMA蛋白表达增加、心肌成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原m RNA表达水平增加,而心肌细胞Peli1敲除则可明显抑制MS-Exos所致心肌成纤维细胞的增殖、分化和胶原合成。上述结果表明,机械过度牵张可通过Peli1调控心肌细胞外泌体介导其对心肌成纤维细胞活化的旁分泌效应。三、Peli1通过心肌细胞外泌体中miR-494-3p介导其对心肌成纤维细胞活化的旁分泌效应1.利用miRNA microarray及设定变化倍数大于2倍和p＜0.05的阈值发现,WT MS-Exos与WT Con-Exos之间符合上述要求的有17种miRNAs,Peli1-/-MS-Exos与WT MS-Exos之间符合要求的有37种miRNAs。进一步筛选,共有8种miRNAs在以上筛选结果共有,结合纤维化信号通路、心肌重塑相关分子以及miRNA靶基因预测数据库,推测miR-494-3p可能靶定PTEN介导其对心肌成纤维细胞活化的调节效应;机械过度牵张可显著诱导心肌细胞、MS-Exos及MS-Exos所致心肌成纤维细胞中miR-494-3p m RNA表达水平的增加,心肌细胞Peli1敲除可明显抑制上述机械过度牵张所致miR-494-3p m RNA表达水平的升高。上述结果提示,Peli1对机械过度牵张刺激的心肌细胞外泌体中miR-494-3p的上调具有调节作用,并进而上调心肌成纤维细胞中miR-494-3p m RNA表达水平。2.与心肌成纤维细胞转染NC的对照组相比,心肌成纤维细胞转染miR-494-3p mimics,可促进其Ed U掺入（Ed U染色）增加、α-SMA m RNA与蛋白表达增加、Ⅰ和Ⅲ型胶原以及结缔组织生长因子m RNA表达水平增加。上述实验结果表明,心肌成纤维细胞过表达miR-494-3p可促进其活化。3.与Sham组相比,TAC可明显增加Peli1F/F小鼠心肌组织miR-494-3p m RNA表达水平,心肌细胞条件性敲除Peli1则可抑制TAC所致miR-494-3p m RNA的高表达水平。提示,心肌细胞Peli1对压力过负荷诱导的心肌组织中miR-494-3p m RNA表达上调具有调控作用。4.体式荧光显微镜观察r AAV9-anti-miR-494-3p或r AAV9-NC在体转染两周后心肌GFP绿色荧光表达,证实,r AAV9可以实现小鼠在体心肌组织转导并到达实验要求的转导效率;TAC可诱导r AAV9-NC小鼠心肌组织中miR-494-3p m RNA水平显著增加,而r AAV9-anti-miR-494-3p心肌组织特异性转导小鼠无论是经过sham手术还是TAC手术,其心肌组织中miR-494-3p m RNA几乎不表达。提示,r AAV9-anti-miR-494-3p心肌特异性转导可明显抑制压力过负荷诱导的心肌组织miR-494-3p高表达。5.与相应的Sham组相比,TAC可导致转导r AAV9-NC小鼠的心脏增大、HW/BW和HW/TL增加、心肌细胞横截面积增加、心肌间质和血管周的胶原沉积增加、心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原以及结缔组织生长因子m RNA表达水平显著增高、心肌组织中羟脯氨酸含量增加,同时IVS、LVPW、LVID、LW/BW增加,而EF和FS则分别下降了33%（42.571±5.584 VS 63.540±3.021,P＜0.001,n=6）和38.9%（20.774±3.036 VS 34.002±2.140,P＜0.001,n=6）,而转导r AAV9-anti-miR-494-3p的小鼠与转导r AAV9-NC的小鼠相比,则可以明显改善上述TAC所致的心肌肥大、心肌纤维化以及心功能障碍。上述实验结果提示,特异性抑制心肌组织miR-494-3p可有效延缓压力过负荷所致的心肌肥大与纤维化并改善心功能障碍。四、心肌细胞外泌体携带的miR-494-3p通过抑制心肌成纤维细胞PTEN表达并激活AKT/Smad2/3/ERK信号通路调控心肌成纤维细胞活化1.报告基因实验表明,miR-494-3p mimics能够减少含有3’UTR序列的野生型PTEN报告基因质粒（WT-PTEN）luciferase活性,而突变WT-PTEN-3’UTR区域后,下调的PTEN luciferase活性重新恢复至接近基础水平,证实miR-494-3p可直接靶定PTEN。2.过表达miR-494-3p mimics或MS-Exos可显著抑制心肌成纤维细胞中PTEN蛋白表达,同时上调心肌成纤维细胞中AKT第308苏氨酸位点（T308）、AKT第473丝氨酸位点（T308/S473）、Smad2第465和467丝氨酸位点（S465/467）、Smad3第423和425丝氨酸位点（S423/425）以及ERK第202苏氨酸位点和第204酪氨酸位点（T202/Y204）磷酸化水平;采用miR-494-3p inhibitors预处理心肌成纤维细胞则可有效抑制MS-Exos对心肌成纤维细胞PTEN的下调和AKT、Smad2/3及ERK上述位点磷酸化增加的作用。提示,MS-Exos可通过其携带的miR-494-3p下调心肌成纤维细胞PTEN并激活AKT,Smad2/3和ERK信号通路。3.与Sham组对比,TAC可显著抑制心肌组织PTEN表达,并上调心肌组织AKT（T308/S473）、Smad2（S465/467）、Smad3（S423/425）以及ERK（T202/Y204）上述位点磷酸化水平;特异性抑制心肌组织miR-494-3p可有效抑制压力过负荷所致心肌组织PTEN的下调和AKT（T308/S473）、Smad2（S465/467）、Smad3（S423/425）以及ERK（T202/Y204）上述位点磷酸化水平的增加。上述实验结果表明,心肌组织miR-494-3p在心脏压力过负荷诱导的心肌组织PTEN表达下调和AKT,Smad2/3和ERK信号通路激活中具有重要调节作用。结论1.心肌细胞条件性敲除Peli1能够改善压力过负荷所致心肌纤维化;机械牵张可以通过Peli1调控心肌细胞旁分泌影响心肌成纤维细胞活化,提示Peli1可以通过调控心肌细胞旁分泌促进压力过负荷所致心肌纤维化。2.心肌细胞Peli1敲除可有效抑制MS-Exos所致的心肌成纤维细胞活化,提示Peli1通过心肌细胞外泌体介导的旁分泌途径促进心肌成纤维细胞的活化。3.心肌细胞Peli1敲除可显著抑制MS-Exos及MS-Exos所致心肌成纤维细胞中miR-494-3p表达的增加,而心肌成纤维细胞过表达miR-494-3p则可诱导其活化;心肌条件性敲除Peli1或r AAV9-anti-miR-494-3p心肌特异性转导均可明显抑制压力过负荷诱导的心肌组织miR-494-3p高表达,同时r AAV9-anti-miR-494-3p心肌组织特异性转导可明显减轻压力过负荷所致的心肌纤维化并改善心功能。上述实验结果提示,Peli1可通过心肌细胞外泌体miR-494-3p介导的旁分泌途径促进心肌成纤维细胞的活化,进而在压力过负荷诱导的心肌纤维化发展进程中发挥重要作用。4.MS-Exos能够通过其携带的miR-494-3p下调心肌成纤维细胞PTEN并激活AKT,Smad2/3和ERK信号通路;特异性抑制心肌组织miR-494-3p可明显逆转心脏压力过负荷诱导的心肌组织PTEN表达下调和AKT,Smad2/3和ERK信号通路激活。上述实验结果提示,心肌细胞外泌体携带的miR-494-3p通过抑制心肌成纤维细胞PTEN表达并激活AKT/Smad2/3/ERK信号通路调控心肌成纤维细胞活化,并与压力过负荷所致的心肌纤维化发生发展密切相关。