论文部分内容阅读
病毒普遍存在于生物体中,极具生态和基因组多样性。昆虫作为地球上已知数量和种类最为丰富的生物类群,是多种病毒的寄主,也是虫媒病毒的重要介体。而相较于已知昆虫和潜在的病毒数量,目前对昆虫病毒的了解还远远不足。近些年来,测序技术的发展加速了昆虫病毒的发现与鉴定,使越来越多的病毒从无症状感染的昆虫宿主中被鉴定出来。黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps是亚洲地区常见的水稻害虫,可以传播多种水稻病毒,如水稻矮缩病毒（rice dwarf virus,RDV）。为探究黑尾叶蝉与RDV的关系,本研究在黑尾叶蝉RDV感毒与未感毒唾液腺转录组分析基础上,选择了差异表达的ML（MD-2-related lipid-recognition）基因,并在载量变化较大的病毒中各选取了一种正链和负链RNA病毒进行了系列研究。主要研究结果如下:1.黑尾叶蝉RDV感毒与未感染唾液腺转录组比较分析通过对RDV感毒与未感毒的黑尾叶蝉唾液腺进行转录组比较分析,发现在感染RDV后共有622个差异表达的基因,其中342个基因表达上调,280个基因下调,对差异基因进行富集分析。选择82个差异基因进行验证,其中52个昆虫基因和10个病毒相关序列通过定量PCR得到确认。相关病毒序列c12476g1、c13775g1、c31720g1和c84382g1在感染RDV后表达水平上升,c31757g1、c44831g1、c53292g1、c57866g1、c57866g2和c18405g1表达下降。2.黑尾叶蝉ML基因鉴定及ML蛋白与RDV互作检验对黑尾叶蝉的ML基因进行鉴定,共发现6个ML基因。选择NcML1、NcML2和NcML6基因进行多序列比对和系统进化树分析,并对其编码的蛋白序列进行三级结构建模。使用q PCR对3个NcML基因在不同组织、不同时期的表达模式进行检测,发现在脑中NcML最为丰富,尤其是NcML6基因。使用酵母双杂交、Pull-Down分别验证NcML1、NcML2和NcML6蛋白是否与RDV病毒蛋白互作,结果显示NcML6蛋白与RDV的Pns6、P8和Pns12蛋白互作结果呈阳性。为了解NcML6基因潜在的功能,对黑尾叶蝉进行RNA干扰。NcML6基因干扰效果良好,但并未引发任何症状。3.一种新型黑尾叶蝉iflavirus病毒基因组结构与传播模式研究对Nephotettix cincticeps positive-stranded RNA virus-1（NcPSRV-1）病毒基因组序列做进一步确认和分析。该病毒基因组长10,524核苷酸（nucleotide,nt）,不计入poly（A）尾,包含一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,该ORF编码一个含3,192个氨基酸（amino acid,aa）的多聚蛋白（polyprotein）。在ORF两侧为5’和3’非编码区（untranslated regions,UTR）。病毒NcPSRV-1具有典型的iflavirus基因组结构,在进化树分析中与Iflaviridae病毒科成员聚类在一起。NcPSRV-1在黑尾叶蝉种群中可进行水平传播和垂直传播。在实验室种群中NcPSRV-1的感染率和病毒载量（viral load）随时间不断增加,维持在较高水平。NcPSRV-1可以侵染黑尾叶近缘种二条黑尾叶蝉N.apicalis,以及黑尾叶蝉的寄生蝇黄足头蝇Pipunculus multillatus,目前尚未有证据显示可以侵染电光叶蝉Recilia dorsalis和水稻Oryza sativa variety TN1。持续RDV感染可改变实验室种群NcPSRV-1的感染率和病毒载量,对NcPSRV-1的增殖抑或传播有一定的拮抗作用。而高NcPSRV-1带毒量的黑尾叶蝉其RDV感毒和传毒的能力逊于NcPSRV-1阴性叶蝉。4.一种新型黑尾叶蝉rhabdovirus病毒基因组结构与进化分析对病毒Nephotettix cincticeps negative-stranded RNA virus-1（NcNSRV-1）基因组序列做进一步确认,获得全长12,361 nt,两端为非编码的3’leader和5’trailer。病毒反义正链的基因组包含5个主要的结构蛋白基因,依次为N、P、M、G和L,是典型的Rhabdoviridae病毒科基因组结构。在G和L基因间,有一个additional gene,命名为P6,该基因具有独立的转录单元,编码一个功能未知的蛋白。系统进化上,NcNSRV-1与昆虫中发现的未分类rhabdovirus病毒聚集在一起,且与其他rhabdovirus病毒在蛋白序列一致性上并不高。转录调节序列一般较为保守,而NcNSRV-1病毒中发现的转录起始序列不同于已分类的rhabdovirus病毒。考虑到进化关系、序列一致性和基因组结构,NcNSRV-1较有可能是昆虫rhabdovirus病毒。目前NcNSRV-1病毒未能在实验室种群中长期维持,可能与宿主或传播途径的缺失有关。