内生真菌是至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中,宿主无明显病症的一类真菌。内生真菌在与植物互作的过程中,产生了许多有意义的生物学功能。首先部分内生真菌的定殖会诱导植物产生系统抗病性,从而抵抗病原真菌、病毒、细菌等的侵害。同时,它产生的一些毒素,可以防止宿主免受食草动物、昆虫的取食。当植物面临非生物胁迫,如旱涝、重金属或高低温等,内生真菌可以通过调控植物的生理生化反应来帮助其渡过不良环境。另外,它可以产生一些代谢产物,用于肿瘤药物的开发,比如说紫杉木霉开发的紫杉醇,还可以促进植物的生长,增产增效。本课题组主要围绕着抗生物胁迫和抗非生物胁迫两个方面,通过从疣粒野生稻根部分离鉴定,获得内生真菌菌株,其中就有一株暗色有隔内生真菌稻镰状瓶霉（Falciphora oryzae）,前期研究工作已经成功建立了稻镰状瓶霉与水稻的共培养体系,通过共培养体系进行稻镰状瓶霉-水稻共生体响应生物与非生物胁迫的机理研究。抗生物胁迫中我们主要是以抗病原菌为主,即内生真菌与植物共生以后是如何引起系统免疫抗性,从而抵御病原菌的侵染。效应蛋白在调控微生物与植物互作中发挥着重要的作用,其中由含有CFEM结构域的蛋白介导的侵染是互作关系建立的基础,但对其研究尚处于探索阶段。本项目研究了CFEM蛋白在稻镰状瓶霉与水稻共生体系、稻瘟病菌与水稻致病体系中的生物学功能,全面解析了CFEM蛋白对生物胁迫的调控机制,明确CFEM蛋白的空间定位,从而揭示了CFEM蛋白调控植物与真菌互作关系的分子机制。抗非生物胁迫中我们主要以耐重金属镉（Cd）胁迫为研究对象。目前,镉污染是一个非常严重的环境问题,镉大米问题也屡见不鲜。因此我们通过研究稻镰状瓶霉耐重金属镉胁迫的分子机制,包括解析稻镰状瓶霉在提高水稻耐镉胁迫方面的生物学功能,来探索稻镰状瓶霉独立响应镉胁迫的潜质,结合蛋白组学和分子生物学技术完成对稻镰状瓶霉中参与调控耐镉胁迫的关键基因的功能分析,进一步阐明稻镰状瓶霉提高水稻耐镉胁迫的分子机理。获得的主要研究结果如下:1.初步筛选出效应蛋白FoCcw14。通过生物信息学分析鉴定出了37个分别包含Lys M、Chitin-binding、Cutinase、CFEM结构域的候选效应蛋白。然后通过在烟草瞬时表达和前期表达量测定,鉴定出FoCcw14作为重点研究蛋白来进行后续的生物学功能分析。2.FoCcw14的生物学功能。FoCCW14的缺失会导致突变体菌株在高渗胁迫下敏感,同时通过FM4-64和CMAC染色,发现突变体的液泡的形态和数量受到严重影响。在突变体中,液泡数量较多,液泡体积较小,较难进一步融合形成较大的液泡形态。3.ΔFoCcw14在水稻根部的定殖模式。ΔFoCcw14突变体菌株在水稻根部定殖量减少。通过将定殖15 d后的水稻根部进行横切和纵切,显微镜下观察发现,与野生型的侵染模式相同,突变体依然是从根毛的基部开始侵染,但是在根毛基部的侵染菌丝明显少于野生型。与此同时,在水稻根部细胞中扩展的菌丝也比野生型少。通过将水稻根部进行纵切我们可以看到,野生型中GFP标记的菌丝最终会到达皮层和内皮层中,而突变体GFP标记的菌丝只在表皮层扩展,无法进入到水稻细胞内部。4.FoCcw14影响水稻的系统抗性。与突变体ΔFoCcw14共生的水稻在进行稻瘟病菌孢子悬浮液喷洒实验以后,叶片出现典型的纺锤状病斑。而与野生型共生的水稻叶片上,病斑小且少。与突变体ΔFoCcw14共生的水稻叶片的发病率比与野生型共生的水稻叶片的发病率高15%。同时,与突变体ΔFoCcw14共生的寄主植株体内的CAT和SOD含量都有一定程度的减少。5.Os GLP2在水稻中的作用。通过酵母双杂交和BiFC等方法鉴定出FoCcw14在水稻中的互作蛋白Os GLP2,Os GLP2在野生型侵染水稻根部早期高表达。通过获得Os GLP2的突变体（Os GLP2-RNAi）并进行稻瘟病菌接种试验,发现在ΔFoCcw14-水稻共生系统中,Os GLP2-RNAi植株比野生型ZH11更感病。6.稻镰状瓶霉对重金属Cd的吸收和积累。稻镰状瓶霉能够在较高浓度的Cd胁迫下生长,同时通过液泡和厚垣孢子来结合和隔绝Cd2+,并通过提高抗氧化水平来中和Cd的毒性。7.稻镰状瓶霉提高水稻对Cd的耐受性。稻镰状瓶霉与水稻共生时,通过将Cd吸收和固定到菌丝的液泡中来减轻Cd对于水稻的毒性,提高水稻对Cd的耐受性,剩余少量的Cd2+可能进入根中并转移到芽中。8.FoSyn1在耐Cd性中的作用。通过蛋白质组学分析鉴定出一个SNARESyntaxin1蛋白FoSyn1（g5337）在Cd胁迫下显著上调表达,FoSYN1的缺失会导致稻镰状瓶霉对Cd的耐受性下降,同时会影响厚垣孢子的形成,阻碍液泡的融合而影响液泡的扩大。ΔFoSyn1接种的水稻在Cd胁迫下出现了发育不良,株高显著降低的现象,影响了共生体系中水稻对Cd的耐受性。