【摘 要】
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研究背景:膀胱癌是世界上第九大最常见的癌症,也是男性第四大最常见的癌症。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）在调控铁死亡的过程中起着关键作用,当GPX4被抑制时能够诱导铁死亡的发生,进而有效的规避肿瘤耐药性问题。多种肿瘤组织中的GPX4表达显著高于正常组织,并且与多种类型癌症患者的预后呈负相关。此外,抑制Nrf2的活性能够显著增强铁死亡诱导剂对多种癌细胞的杀伤作用。研究目的:本课题以Nrf2和GPX4
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研究背景:膀胱癌是世界上第九大最常见的癌症,也是男性第四大最常见的癌症。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）在调控铁死亡的过程中起着关键作用,当GPX4被抑制时能够诱导铁死亡的发生,进而有效的规避肿瘤耐药性问题。多种肿瘤组织中的GPX4表达显著高于正常组织,并且与多种类型癌症患者的预后呈负相关。此外,抑制Nrf2的活性能够显著增强铁死亡诱导剂对多种癌细胞的杀伤作用。研究目的:本课题以Nrf2和GPX4作为诱导膀胱癌发生铁死亡的潜在靶点,探讨靶向Nrf2/GPX4对膀胱癌细胞的作用效果及其分子机制,为膀胱癌的靶向治疗提供新思路。研究方法:首先通过Hoglund数据库和蛋白免疫印迹（Western blotting）分析GPX4与膀胱癌的关系;然后,选择膀胱癌细胞EJ和T24为研究对象,通过MTT和克隆形成实验检测单独靶向GPX4以及靶向Nrf2/GPX4对细胞增殖的影响;通过多种抑制剂干预、流式实验、免疫荧光、MDA检测以及Western blotting确定靶向Nrf2/GPX4诱导的膀胱癌细胞死亡方式;最后,通过Wound-healing和Transwell检测靶向Nrf2/GPX4对膀胱癌转移的影响。研究结果:（1）Hoglund数据库中224例膀胱癌患者的生存数据显示,GPX4低表达患者的总生存率明显优于GPX4高表达患者;Western blotting结果显示,恶性膀胱癌细胞EJ、T24中GPX4的表达明显高于良性膀胱癌细胞BIU。这提示GPX4的表达水平与膀胱癌的恶性程度呈正相关。（2）MTT和克隆形成结果显示,单独靶向GPX4对膀胱癌细胞存活率的影响不显著,但靶向Nrf2/GPX4则可以显著降低膀胱癌细胞的存活率。（3）Western blotting结果显示,靶向Nrf2/GPX4可以下调铁死亡相关蛋白GPX4、x CT和Nrf2通路相关蛋白,自噬相关蛋白p62的表达量也降低,而LC3的表达量增加;MDA结果显示,靶向Nrf2/GPX4显著升高了膀胱癌细胞中的脂质过氧化水平;JC-1荧光探针结果显示,靶向Nrf2/GPX4显著降低了膀胱癌细胞的线粒体膜电位;免疫荧光结果显示,靶向Nrf2/GPX4使膀胱癌细胞中的LC3明显累积。这提示靶向Nrf2/GPX4可能诱导膀胱癌细胞发生铁死亡和自噬,并抑制Nrf2信号通路。（4）添加铁死亡抑制剂（Fer-1、DFO、Trolox）几乎完全逆转了靶向Nrf2/GPX4诱导的膀胱癌细胞死亡;添加自噬抑制剂（Baf-A1）和RIPK1抑制剂（Nec-1）,部分细胞死亡受到抑制;添加pan-Caspase抑制剂（Z-VAD-FMK）、RIPK3抑制剂（GSK872、GSK840）以及ROS清除剂（NAC）,细胞死亡均未受到抑制。这提示靶向Nrf2/GPX4诱导的膀胱癌细胞死亡主要为铁死亡。（5）Western blotting显示,铁死亡抑制剂（Fer-1、DFO、Trolox）使自噬相关蛋白LC3、p62以及Nrf2通路相关蛋白的表达均恢复;同样地,自噬抑制剂Baf-A1也使铁死亡相关蛋白GPX4以及Nrf2通路相关蛋白的表达也得以恢复。这提示靶向Nrf2/GPX4诱导膀胱癌细胞发生的铁死亡与自噬相互促进,且两者均抑制Nrf2信号通路。（6）Western blotting结果显示,RIPK1抑制剂（Nec-1）使自噬相关蛋白LC3明显下调,而p62明显上调,并且铁死亡相关蛋白和Nrf2通路相关蛋白的表达水平也发生了部分上调。这提示RIPK1抑制剂（Nec-1）可能通过抑制自噬从而影响铁死亡和Nrf2信号通路,使细胞的存活率增加。（7）Wound-healing和Transwell结果显示,靶向Nrf2/GPX4明显抑制了膀胱癌细胞的转移。结论:膀胱癌细胞中Nrf2/GPX4信号通路处于激活状态,靶向Nrf2/GPX4可诱导膀胱癌细胞以铁死亡和自噬方式调控细胞死亡,而与凋亡、程序性坏死和ROS无显著相关性,此外,靶向Nrf2/GPX4还能够显著抑制膀胱癌细胞的转移。
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