多糖有多种生物活性,如增强机体的免疫功能,抗衰老、防癌、降血糖等作用。对多糖进行分子修饰,改变多糖的空间结构、取代基种类、数目和位置,可以增强它的原有活性或增加新的生物活性。许多多糖经结构修饰以后,免疫效果显著提升,如硫酸化麦冬多糖、羧甲基化黄芪多糖、硒化当归多糖等。一些多糖经羟乙基化修饰后,免疫活性显著提高,如茯苓多糖、牛膝多糖等。大量研究表明猴头菇多糖提高机体免疫力方面有很好的功效,并且本试验前期研究表明,羟乙基化修饰可以提高猴头菇多糖对DCs抗原提呈活性,并促进IL-12、IL-18和IFN-γ等免疫因子的分泌,又由于DC细胞和NK细胞相互作用在机体免疫中发挥着重要作用,所以本试验通过对猴头菇多糖进行羟乙基化修饰,并探讨羟乙基化猴头菇多糖对DC细胞和NK细胞相互作用的影响。实验分为以下几个部分:1.以猴头菇多糖为材料,通过羟乙基化反应对多糖进行修饰得到HE-HEP。2.细胞模型的建立:从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞,体外使用rmIL-4和rmGM-CSF诱导其成为成熟的树突状细胞;从小鼠的脾脏中提取脾淋巴细胞,体外用rmIL-2作用细胞,不断纯化得到小鼠脾源自然杀伤细胞。在光学显微镜下观察细胞的形态变化并用流式细胞仪检测DC细胞CD40、CD86、CD11c和MHCⅡ和NK细胞CD107a和CD49b的表达。分别将NK细胞与DC细胞以1:5的比例混合培养,建立DC细胞和NK细胞相互作用模型。3.首先通过多糖毒力试验得到HEP和HE-HEP的安全浓度,然后多糖作用于DC细胞,将DC细胞作用于T淋巴细胞,得到DC细胞对T淋巴细胞增值时多糖的最佳浓度。然后将多糖作用于两种细胞,应用ELISA法验检测多糖对DC细胞抗原递呈能力的影响和IL-12、IL-15、IL-18的分泌情况以及荧光定量PCR的方法检测IL-12、IL-15、IL-18、NF-κB、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α 和 NKG2D 的 mRNA 的表达。4、western blot检测DCs细胞浆蛋白的IκB-α、IκB-β水平和细胞细胞核蛋白NF-κB p65、NF-κB p50水平。结果表明(1)NK细胞可以增强成熟DC细胞抗原递呈能力。DC细胞单独培养或者NK细胞与DC细胞以1:5的比例混合培养,一定浓度的HEP和HE-HEP均可以时DC细胞的抗原递呈能力提高(2)NK细胞与DC细胞混合培养后可以使IL-12、IL-15、NF-κB分泌增加.当NK细胞与DC细胞以1:5的比例混合培养加多糖作用后,HEP和HE-HEP在这五个浓度范围内均可以增加IL-12的分泌。HE-HEP对DC细胞分泌IL-12的影响比HEP高,在浓度为250 μg/mL、125μg/mL、62.5 μg/mL时,DC细胞的IL-15的分泌显著著增高,HE-HEP在这五个浓度均可以使IL-18和的分泌增加,而HEP影响不显著。(3)当NK细胞与DC细胞以1:5的比例混合培养加糖作用后,在浓度为15.625 μg/mL 到 62.5 μg/mL 时,HEP 和 HE-HEP 均可以促进 IL-12的mRNA的表达,HEP和HE-HEP的效果一样。在浓度为15.625μg/mL到250μg/mL时,HEP和HE-HEP均可以促进IL-12的mRNA的表达,HE-HEP 的效果比 HEP 好。在 31.25 μg/mL 和 15.625 μg/mL这两个浓度时,HE-HEP的效果在促进IL-15的mRNA表达方面明显强于HEP。浓度为31.25 μg/mL和62.5 μg/mL时,HE-HEP的效果在促进NF-κB的mRNA表达方面明显强于HEP。当NK细胞与DC细胞以5:1的比例混合培养加糖作用后,相同浓度时,在对NK细胞TNF-α和NKG2D的mRNA表达上,HE-HEP效果大于HEP;在对NK细胞IFN-γ的mRNA表达上,HE-HEP在高浓度时大于HEP,HEP在低浓度时效果优于HE-HEP。HEP在浓度为31.25 μg/mL时,GM-CSF 的 mRNA 表达,HE-HEP 在 125 μg/mL 时,NK 细胞 GM-CSF的mRNA表达显著升高。(4)HEP和HE-HEP可以增强IκB-α和IκB-β蛋白降解、促进DCs表达p50和p65蛋白,并且HE-HEP的效果强于 HEP。由以上结果表明羟乙基化修饰可以显著提高猴头菇多糖对DC细胞与NK细胞的相互作用及其免疫活性,并可以增强猴头菇多糖通过激活NF-κB信号通路来诱导DC对NK细胞的作用。