论文部分内容阅读
本文为了提高CTP疫苗的免疫原性，利用基因工程的方法将2、3、4个CTP以头尾串联的方式重组成多聚体基因(CTP)n(n=2，3，4)cDNA，利用巴氏毕赤酵母表达CTP多聚体，表达得到的CTP多聚体可用于制备CTP疫苗。构建了重组表达质粒pPIC9K-Cα-(CTP)n(n=2，3，4)，再将表达质粒电转染入毕赤酵母GS115细胞。然后，利用不同浓度的G418对转化子进行筛选，以得到含高拷贝pPIC9K-Cα-(CTP)n(n=2，3，4)的转化子。筛选得到的转化子在甲醇诱导下进行表达。SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Westernblot分析结果表明，成功地在毕赤酵母中表达到了CTP多聚体。而且其实际分子量较理论分子量将近大一倍，这表明表达产物可能已被糖基化修饰。
采用大肠杆菌DL21表达了CTP多聚体，并制备了相应的多克隆抗体。在构建好表达质粒pGEX4T-2-(CTP)n(n=3，4)后，将其转入大肠杆菌DL21获得转化子。转化子经DNA测序鉴定后，经IPTG诱导表达，产生了大量的融合蛋白GST-CTPn(n=3，4)。表达产物经谷胱甘肽转硫酶(GST)亲和层析柱纯化，得到纯度为90％以上的融合蛋白。融合蛋白经凝血酶切除GST后，经制备型SDS-PAGE纯化回收，得到纯度大于80％的多肽CTP3和CTP4。然后将多肽CTP3和CTP4用常规方法免疫家兔，以制备相应的多克隆抗体。ELISA检测结果显示，获得了较高滴度的抗体；且四聚体诱导产生的抗体滴度高于三聚体，抗三聚体抗体和抗四聚体抗体的滴度均明显高于抗CTP单聚体抗体滴度。