论文部分内容阅读
目的:结核性脑膜炎是肺外结核最严重的临床表现形式,具有很高的发病率和死亡率。近年来,非结核分枝杆菌脑膜炎的发病率也越来越高,而传统的实验室检查方法却很难鉴别这两种感染。二代基因测序技术应用于感染性疾病的报道日益增多,但是分枝杆菌由于细胞结构特殊,其核酸提取相对困难,因此二代测序检测分枝杆菌属的阳性率较低。该研究拟对脑脊液痕量病原体核酸的提取方法进行探索和优化,并基于二代基因测序技术对中枢神经系统结核相关性感染进行鉴别诊断,比较两者的临床差异。
方法:我们首先进行了脑脊液痕量病原体核酸提取技术的探索和优化,所用到的样本为由检验科提供的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、新型隐球菌菌株及卡介苗制成的标准菌液,以及所在医院脑脊液室提供的脑脊液样本。之后我们分别比较了溶菌酶、溶壁酶、核酸助沉剂、细胞游离DNA、细胞内DNA以及不同试剂盒对脑脊液DNA的提取效果,并筛选出适合该研究的DNA提取方法。
其次我们对2013年12月至2018年4月份期间收入所在医院脑脊液细胞学检查室的1083份疑似感染脑脊液标本进行了二代测序回顾性研究。样本的纳入标准为:具有以下症状体征(头痛、发热、呕吐、易激惹、颈强直、抽搐、意识障碍或局灶性神经缺损)或脑脊液细胞学、生化异常。测序平台为IlluminaMiniseq测序仪,实验过程中严格设置无菌水作为阴性对照、已知浓度的质粒DNA作为阳性质控,并将同一批次测序结果进行样本间比较来判断此次实验是否存在污染,NGS阳性结果根据目前已发表文献进行判读。对检测到的分枝杆菌属阳性样本进行改良抗酸染色,以及文库PCR、一代测序验证和LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)方法探索。之后搜集整理这些患者的临床病例信息,对其进行结核性脑膜炎LCSS(Lancet Consensus Scoring System)评分并从脑脊液改良抗酸阳性率、脑脊液细胞学、脑脊液生化检查、二代测序特异性序列数等方面比较了结核分枝杆菌复合群组和非结核分枝杆菌组的临床差异。
结果:第一部分实验中,在对脑脊液痕量核酸提取方法的优化中我们发现,在无菌水中加入溶壁酶也会提取到核酸,而不加溶菌酶则提取不到,因此我们认为溶菌酶试剂本身可能含有微生物核酸序列,在脑脊液DNA提取过程中会对结果产生干扰和影响,因此不适用于脑脊液痕量核酸的提取。溶菌酶在250mg/mL浓度反应30分钟时效果最好。核酸助沉剂CarrierRNA在脑脊液DNA提取过程中效果不明显。细胞游离DNA由于人源性核酸及细胞杂质相对较少,比起细胞内DNA更适合脑脊液二代测序,针对细胞游离DNA进行提取的国产DNA提取试剂盒在实验中表现更出色。
第二部分实验中,通过二代测序我们共检测到了210例分枝杆菌属核酸阳性样本,其中18例临床信息不全,对余下的192例临床信息进行整理分析。这192例样本包含101例(52.60%)结核分枝杆菌复合群,78例(40.63%)非结核分枝杆菌和13例(6.77%)结核分枝杆菌复合群合并非结核分枝杆菌。有95例(49.48%)改良抗酸染色阳性,其中结核分枝杆菌复合群占67.37%,非结核分枝杆菌占24.21%,两者均阳性占8.42%。192例二代测序阳性文库PCR共有167例阳性,阳性率为86.98%,敏感性低于二代测序。2例二代测序、传统检验方法均阳性的结核性脑膜炎脑脊液LAMP为阴性,LAMP在中枢神经系统结核相关性感染的应用需要进一步研究。我们比较了结核性脑膜炎与非结核分枝杆菌脑膜炎的临床特点,结核性脑膜炎组LCSS评分、改良抗酸阳性率要高于非结核分枝杆菌脑膜炎,而脑脊液糖和氯化物浓度则更低。脑脊液细胞学总体上无差异,但是在10-500/mm3分段,结核性脑膜炎组脑脊液白细胞数要高于非结核性脑膜炎组。我们发现这些临床差异不足以区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌,二代测序技术可以应用于中枢神经系统结核相关性感染的鉴别诊断。
结论:中枢神经系统感染时脑脊液中的病原体核酸很少,其他体液适用的检验方法在脑脊液的痕量核酸检测中往往不那么敏感,需要我们对检验方法进行一定的优化。中枢神经系统结核相关性感染如结核性脑膜炎和非结核分枝杆菌脑膜炎在症状体征、实验室检查和影像学上缺乏特异性,传统方法无法鉴别。非结核分枝杆菌脑脊液抗酸也是阳性,因此不能根据临床症状和脑脊液抗酸染色阳性确诊结核性脑膜炎,二代测序技术可以应用于中枢神经系统结核相关性脑膜炎的鉴别诊断。
方法:我们首先进行了脑脊液痕量病原体核酸提取技术的探索和优化,所用到的样本为由检验科提供的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、新型隐球菌菌株及卡介苗制成的标准菌液,以及所在医院脑脊液室提供的脑脊液样本。之后我们分别比较了溶菌酶、溶壁酶、核酸助沉剂、细胞游离DNA、细胞内DNA以及不同试剂盒对脑脊液DNA的提取效果,并筛选出适合该研究的DNA提取方法。
其次我们对2013年12月至2018年4月份期间收入所在医院脑脊液细胞学检查室的1083份疑似感染脑脊液标本进行了二代测序回顾性研究。样本的纳入标准为:具有以下症状体征(头痛、发热、呕吐、易激惹、颈强直、抽搐、意识障碍或局灶性神经缺损)或脑脊液细胞学、生化异常。测序平台为IlluminaMiniseq测序仪,实验过程中严格设置无菌水作为阴性对照、已知浓度的质粒DNA作为阳性质控,并将同一批次测序结果进行样本间比较来判断此次实验是否存在污染,NGS阳性结果根据目前已发表文献进行判读。对检测到的分枝杆菌属阳性样本进行改良抗酸染色,以及文库PCR、一代测序验证和LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)方法探索。之后搜集整理这些患者的临床病例信息,对其进行结核性脑膜炎LCSS(Lancet Consensus Scoring System)评分并从脑脊液改良抗酸阳性率、脑脊液细胞学、脑脊液生化检查、二代测序特异性序列数等方面比较了结核分枝杆菌复合群组和非结核分枝杆菌组的临床差异。
结果:第一部分实验中,在对脑脊液痕量核酸提取方法的优化中我们发现,在无菌水中加入溶壁酶也会提取到核酸,而不加溶菌酶则提取不到,因此我们认为溶菌酶试剂本身可能含有微生物核酸序列,在脑脊液DNA提取过程中会对结果产生干扰和影响,因此不适用于脑脊液痕量核酸的提取。溶菌酶在250mg/mL浓度反应30分钟时效果最好。核酸助沉剂CarrierRNA在脑脊液DNA提取过程中效果不明显。细胞游离DNA由于人源性核酸及细胞杂质相对较少,比起细胞内DNA更适合脑脊液二代测序,针对细胞游离DNA进行提取的国产DNA提取试剂盒在实验中表现更出色。
第二部分实验中,通过二代测序我们共检测到了210例分枝杆菌属核酸阳性样本,其中18例临床信息不全,对余下的192例临床信息进行整理分析。这192例样本包含101例(52.60%)结核分枝杆菌复合群,78例(40.63%)非结核分枝杆菌和13例(6.77%)结核分枝杆菌复合群合并非结核分枝杆菌。有95例(49.48%)改良抗酸染色阳性,其中结核分枝杆菌复合群占67.37%,非结核分枝杆菌占24.21%,两者均阳性占8.42%。192例二代测序阳性文库PCR共有167例阳性,阳性率为86.98%,敏感性低于二代测序。2例二代测序、传统检验方法均阳性的结核性脑膜炎脑脊液LAMP为阴性,LAMP在中枢神经系统结核相关性感染的应用需要进一步研究。我们比较了结核性脑膜炎与非结核分枝杆菌脑膜炎的临床特点,结核性脑膜炎组LCSS评分、改良抗酸阳性率要高于非结核分枝杆菌脑膜炎,而脑脊液糖和氯化物浓度则更低。脑脊液细胞学总体上无差异,但是在10-500/mm3分段,结核性脑膜炎组脑脊液白细胞数要高于非结核性脑膜炎组。我们发现这些临床差异不足以区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌,二代测序技术可以应用于中枢神经系统结核相关性感染的鉴别诊断。
结论:中枢神经系统感染时脑脊液中的病原体核酸很少,其他体液适用的检验方法在脑脊液的痕量核酸检测中往往不那么敏感,需要我们对检验方法进行一定的优化。中枢神经系统结核相关性感染如结核性脑膜炎和非结核分枝杆菌脑膜炎在症状体征、实验室检查和影像学上缺乏特异性,传统方法无法鉴别。非结核分枝杆菌脑脊液抗酸也是阳性,因此不能根据临床症状和脑脊液抗酸染色阳性确诊结核性脑膜炎,二代测序技术可以应用于中枢神经系统结核相关性脑膜炎的鉴别诊断。