大量研究表明,Aβ聚集形成老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)发生发展的中心环节。Ap是由p淀粉样前体蛋白(APP)经过p-分泌酶和γ-分泌酶剪切产生的含有39-42个氨基酸的多肽。APP的裂解有两种途径：(1)非淀粉样途径,由α、γ-分泌酶参与,裂解位点在Aβ之间,此途径不产生Aβ；(2)淀粉样途径：由p、γ-分泌酶参与,此途径形成Aβ,进而聚集形成老年斑。实验显示,Aβ集聚和纤维斑块的形成对脑内神经细胞有很强的毒性作用,可引起氧化应激和炎症反应,形成离子通道,破坏细胞内外离子平衡,降低神经细胞膜两侧的跨膜电位,损伤胆碱神经系统、影响胆碱能神经信号传递,诱导神经元细胞凋亡等,最终导致痴呆的发生。因此,通过降低β、γ-分泌酶活性、提高α-分泌酶活性来有效抑制Aβ的产生,可能对阿尔茨海默病的发生发展具有潜在抑制作用。中药资源在我国有着悠久的治疗疾病历史。研究表明,有些中药成分能够改善动物模型的认知和记忆能力。本实验室现有2种双基因转染细胞模型(能过表达Aβ和p-分泌酶的细胞模型及能过表达Ap和γ-分泌酶的细胞模型),能够自然模拟Aβ和β、γ-分泌酶的过表达；有2种转基因动物模型(APP转基因模型鼠：又称J20鼠,APP/PS1双转基因模型鼠：又称5XFAD鼠),能够自然模拟AD的病理学特征,并且发病早,病理学特征比较明显。本课题首先从现有文献中选出10种具有改善AD动物模型记忆和认知能力的中药成分,分别利用2种双基因稳定转染细胞模型对其抑制Aβ效果和相关机制进行探讨,然后用2种转基因动物模型对其药效学进行验证。本课题的研究内容主要包括二个部分：(1)筛选对体外过表达Ap有抑制作用的中药成分及机制探讨,(2)2种中药成分对2种转基因AD模型鼠的体内药效学观察第一部分：筛选对体外过表达Aβ有抑制作用的中药成分及机制探讨目的：筛选对双基因转染细胞模型过表达p-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,简称：Aβ)有抑制作用的中药成分,并探讨其可能机制。方法：从资料中选出10种具有潜在改善AD症状的中药成分,分别以不同药物浓度(0.5-100μmol·L-1)作用于两种双基因转染细胞模型(117细胞模型：过表达Aβ和β-分泌酶；146细胞模型：过表达Aβ和γ-分泌酶),24-48h后,ELISA法测定各组细胞外Ap水平,初筛出具有降低细胞外Ap的中药成分,并估算其最佳的作用浓度范围,然后在其最佳浓度范围内,设定浓度梯度,作用于两种细胞模型,分别观察其对细胞形态、活力及凋亡率的影响,并分析其对模型细胞内Ap水平、p、γ-分泌酶活性的作用效果。结果：1、经过筛选发现10种中药成分中有4种能够明显抑制两细胞模型内、外Ap水平,且对细胞内Ap的最高抑制率大于细胞外。2、这4种中药成分分别为：隐丹参酮、黄芪总皂苷、芍药苷和天麻素。它们对117细胞内Aβ的最高抑制率依次为：82.0%、75.9%、75.2%、73.8%,细胞外的最高抑制率依次为：76.5%、73.6%、72.6%、68.9%,对146细胞内的Aβ最高抑制率依次为：88.1%、70.3%、74.4%、82.0%,细胞外的Ap最高抑制率依次为：84.2%、67.1%、72.4%、75.4%。3、进一步的研究表明,黄芪总皂苷对β-分泌酶的活性有明显抑制作用,最高抑制率为78.2%,未见对γ-分泌酶的影响；天麻素对γ-分泌酶活性有明显抑制作用,最高抑制率为80.3%,未见对p-分泌酶的影响。隐丹参酮和芍药苷对β、γ-分泌酶未见有影响。4、细胞形态学、MTT和凋亡实验证实了上述的中药成分抑制Aβ、β-分泌酶和γ-分泌酶的作用是在不影响细胞活性下实现的。小结：1、隐丹参酮、黄芪总皂苷、天麻素和芍药苷能够显著抑制117和146细胞模型内外Aβ的水平,这种抑制作用具有浓度依赖性。2、黄芪总皂苷抑制Aβ的作用机制可能与其抑制了p-分泌酶的活性有关,天麻素抑制Ap的作用机制可能与其抑制了Y-分泌酶的活性有关。隐丹参酮和芍药苷对Aβ的机制有待进一步探讨。第二部分：2种中药成分对2种转基因AD模型鼠的体内药效学观察目的：研究第一部分中筛出的分别具有抑制p、γ-分泌酶活性成分(黄芪总皂苷(AST)和天麻素(GAS))对AD模型鼠行为学改善和脑内Aβ斑块的抑制效果。方法：分别选用5XFAD鼠和J20鼠进行实验。1、5XFAD鼠实验方法,选用56只2月龄APP/PS1双基因阳性小鼠,随机分为7组,每组8只,另取同窝阴性小鼠8只作为正常对照。(1)阳性对照组(Tg)：每天饮用等量生理盐水；(2)阴性对照组(Control):每天饮用等量生理盐水；(3)黄芪总皂苷高剂量组(AST-H):每天饮用浓度为2mg/mL的黄芪总皂苷溶液;(4)黄芪总皂苷中剂量组(AST-M):每天饮用浓度为lmg/mL的黄芪总皂苷溶液；(5)黄芪总皂苷低剂量组(AST-L):每天饮用浓度为0.5mg/mL的黄芪总皂苷溶液;(6)天麻素高剂量组(GAS-H):每天饮用浓度为5mg/mL的天麻素溶液；(7)天麻素中剂量组(GAS-M):每天饮用浓度为2.5mg/mL的天麻素溶液；(8)天麻素低剂量组(GAS-L):每天饮用浓度为1.25mg/mL的天麻素溶液。2、J20鼠实验方法,选用35只3月龄的小鼠,随机分为7组,每组5只,另取同窝阴性小鼠5只作为正常对照,分组与给药方法同5XFAD鼠。给药3个月后,用Morris水迷宫测试模型鼠的空间学习记忆能力变化,ELISA双抗体夹心法检测模型鼠脑组织匀浆液中Ap水平,免疫组化染色法观察模型鼠脑切片Aβ斑块变化并进行定量分析。结果：1、水迷宫结果：1)、隐性平台寻找实验结果,小鼠寻找隐性平台所用时间越短,代表其学习认知越好。5XFAD和J20模型鼠的AST和GAS各组寻找隐性平台的时间与Tg组相比,均明显缩短；训练5天后,与Tg组相比,5XFAD模型鼠的AST-H和GAS-H组分别缩短了49.91%和50.60%(P<0.01),AST-M和GAS-M组分别缩短了33.11%和38.63%(P<0.05)；J20模型鼠的AST-H和GAS-H组分别缩短了49.01%和50.36%(P<0.01),AST-M和GAS-M组分别缩短了39.88%和40.60%(P<0.05)。2)、空间探索实验结果,小鼠在目标象限逗留时间越长,表明其空间记忆能力和空间定位的准确性越好。与Tg组相比,5XFAD和J20模型鼠的AST和GAS各组在目标象限逗留时间明显延长：其中,5XFAD模型鼠的AST-H和GAS-H组分别为Tg组的2.40和2.46倍(P<0.01),AST-M和GAS-M组分别为Tg组的1.59和1.74倍；J20模型鼠的AST-H和GAS-H组分别为Tg组的2.03和2.31倍(P<0.01),AST-M和GAS-M组分别为Tg组的1.84和2.08倍(P<0.05)。2、模型鼠脑匀浆Aβ水平检测结果：ELISA结果显示：与Tg组的脑匀浆中Aβ的平均OD值相比,AST和GAS各组均有不同程度降低。其中,5XFAD鼠AST-H(1.15)和GAS-H(1.04)组与Tg组(2.35)相比,分别下降了51.06%和55.74%；J20鼠AST-H(1.18)和GAS-H组(1.07)与Tg组(2.49)相比分别下降了52.61%和57.03%(P<0.01)。3、免疫组织化学结果：1)、光学显微镜下显示,J20和5XFAD鼠的Tg组脑内海马和皮质区可见明显的大小不一、棕黄色的Ap斑块沉积,呈弥漫分布。AST和GAS各组与Tg组相比,脑内海马和皮质区Ap斑块呈散在分布,斑块体积和数目显著减少、染色变浅。2)、IPP软件定量分析表明,海马区的Aβ阳性面积与Tg组相比,5XFAD鼠的AST-H和GAS-H组分别减少了91.46%和93.28%,J20鼠的AST-H和GAS-H组分别减少了90.27%和93.84%(P<0.01)。皮质区的Aβ阳性面积与Tg组相比,5XFAD鼠的AST-H和GAS-H组分别减少了84.94%和88.88%,J20鼠的AST-H和GAS-H组分别减少了87.99%和91.72%(P<0.01)。小结：1、AST和GAS能使5XFAD和J20鼠的寻找平台时间缩短；在目标象限停留时间延长；显著改善了2种转基因模型鼠的空间学习认知记忆和定位能力,并且这种改善效果呈浓度依赖性。2、AST和GAS明显降低了5XFAD和J20鼠脑匀浆内Ap水平,有抑制Ap产生的作用。3、AST和GAS显著抑制了5XFAD和J20鼠海马和皮质区Ap的聚集和斑块的形成。这可能与AST抑制了p-分泌酶的活性,GAS抑制了γ-分泌酶的活性,阻断了Ap过度产生有关。