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阿卡波糖是常用的Ⅱ型糖尿病治疗药物,主要由游动放线菌发酵生产。野生型菌种往往发酵单位较低,传统的育种方法及发酵调控虽然使发酵单位有所提高,但基于此的阿卡波糖发酵水平已达到瓶颈,并且发酵过程中伴随多种杂质组分的产生,这些杂质组分与阿卡波糖结构类似,难以在后期分离过程中除去,而欧洲药典又对其有严格限量。本文以葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等9种糖化合物为碳源,对Actinoplanes sp.ZJB-03852进行发酵培养,考察不同糖化合物对阿卡波糖及其杂质组分形成的影响,并采用2D-DIGE与MALDI-TOF/TOF-MS联用的蛋白质组学研究方法,从蛋白质水平解析了不同糖化合物对阿卡波糖及其杂质组分形成的影响机制。本文采用9种糖化合物对Actinoplanes sp.ZJB-03852进行发酵培养,发现:(1)除木糖外的8种糖化合物均能被菌体利用,但仅含麦芽糖、麦芽三糖的培养基能使菌体产生阿卡波糖;(2)组分C的生成总是滞后或伴随海藻糖的生成,因此推测组分C的合成与海藻糖相关;(3)葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖培养下,菌体趋向于生成含相应糖单位的组分,分别为组分D、阿卡波糖、组分F。本文选取葡萄糖为碳源的培养条件作为对照组,麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖-麦芽糖为碳源的培养条件为实验组,采用2D-DIGE进行Actinoplanes sp.ZJB-03852胞内、胞外差异蛋白的分析。盐离子、核酸等杂质严重干扰2D-DIGE,因此需对样品进行预处理。本文采用SDS-PAGE对Actinoplanes sp.ZJB-03852细胞破碎方法、蛋白提取介质,以及胞内、胞外蛋白沉淀除杂方法进行筛选。结果表明Fast-Prep机械均质进行细胞破碎,以50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)作为蛋白提取介质,并添加蛋白酶抑制(protease inhibitor cocktail,Roche)和蛋白磷酸酶抑制剂(PhopStop,Roche),蛋白提取效果较好。胞内、胞外蛋白样品采用Tris-饱和酚抽提-甲醇沉淀的方法除杂效果较好,样品采用pH3-10NL,24 cm的IPG胶条进行一向分离,10.5%SDS-PAGE进行二向分离,上样量为30μg,蛋白分离效果较好,适用于Actinoplanes sp.ZJB-03852胞内、胞外差异蛋白的分离和分析。2D-DIGE分析得到的Actinoplanes sp.ZJB-03852胞内、胞外差异蛋白采用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定。结果表明胞内阿卡波糖合成途径相关酶系AcbV、AcbN、AcbL在含麦芽糖或麦芽三糖的培养基中表达上调,而AcbK表达反而下调,胞外的AcbD表达则无显著差异。另外还发现谷氨酸合成酶GlnA在含麦芽糖或麦芽三糖的培养基中表达上调。胞外的差异蛋白主要为糖转运途径相关蛋白,其中AglE在葡萄糖+麦芽糖培养下表达上调,MalE在含麦芽糖的培养条件下表达下调,MstE和ChvE则在葡萄糖培养下表达上调。蛋白质组学研究结果认为AcbV、AcbN、AcbL和GlnA是阿卡波糖合成关键酶,AcbK及糖转运途径相关蛋白的表达差异导致了不同糖化合物作用下Actinoplanes sp.ZJB-03852趋向于合成含相应糖单位的杂质组分。