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第一部分 CRNDE在脑胶质瘤中的表达变化及其与临床病理特征的相关性研究目的:探讨不同级别脑胶质瘤及瘤旁组织中长链非编码RNA CRNDE的差异表达;以及CRNDE的表达水平与肿瘤临床病理特征之间的相关性。方法:1.组织标本的收集:采集自2010-2012年在河北医科大学第二医院神经外科行脑胶质瘤切除术获取的肿瘤组织标本以及对应的瘤旁组织的标本164例,保存于2ml无菌冻存管并立即投至液氮中速冻。2.通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)技术,分别检测CRNDE的相对表达水平,并比较其在不同级别脑胶质瘤及瘤旁组织中的表达情况。表达量以均数±标准差表示,组间比较采用t检验进行分析。3.采用交叉分类2*2表的关联性分析探讨164例胶质瘤组织中CRNDE的表达水平与临床病理特征之间的关系。结果:1.与瘤旁组织(1.00±0.06)比较,CRNDE在脑胶质瘤组织(3.49±1.71)中的相对表达量显著上调,差异具有显著性(P<0.05)。2.CRNDE的相对表达量与肿瘤分级呈明显正相关,与低级别胶质瘤组(1.51±0.86)相比,高级别胶质瘤组(4.26±1.29)中CRNDE相对表达量升高更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。3.CRNDE表达量与患者性别、年龄、术前症状、肿瘤是否坏死之间无显著相关性,P值分别为0.35、0.59、0.38、0.49,表达差异无统计学意义。4.CRNDE相对表达量与肿瘤直径、肿瘤级别、肿瘤复发之间有相关性,P值分别为0.01、0.001、0.008有统计学意义;进一步分析CRNDE表达水平与肿瘤直径、肿瘤病理级别、肿瘤复发的列联系数为0.2、0.38、0.2。第二部分CRNDE表达水平及相关临床病理特征与脑胶质瘤患者预后的多因素生存分析目的:探讨影响脑胶质瘤患者生存和预后的临床相关因素,从而更加准确地判断脑胶质瘤患者的预后情况,以期指导患者的后续治疗。方法:1.病例资料的收集:本组164例患者从手术到死亡的时间为3-65个月,平均随访时间为43.8±19.8个月,记录患者的性别、年龄、术前症状、肿瘤直径、肿瘤复发情况、WHO分级、肿瘤坏死及CRNDE表达水平。2.首先采用Kaplan-Meier法进行单因素分析并绘制生存曲线,以生存时间为非独立变量,分别考察患者临床病理特征和CRNDE表达水平等因素对生存时间的影响。各个因素对患者生存时间影响的显著性差异采用Log-rank法进行分析。3.对单因素分析中P<0.05者以前进法(Forward:LR)进行Cox回归多因素模型分析。结果:1.单因素分析:肿瘤复发情况、WHO分级、肿瘤坏死及CRNDE表达水平对胶质瘤患者的预后有影响,具有统计学意义(P<0.05)。肿瘤复发组的死亡风险度是不复发组的2.23倍,复发组的中位生存期是34个月,未复发组的中位生存期是58个月;高级别组的死亡风险度是低级别组的3.87倍,高级别组的中位生存期是32个月,低级别组的中位生存期是57个月;CRNDE高表达组的死亡风险度是低表达组的2.24倍,CRNDE高表达组的中位生存期是42个月,低表达组的中位生存期55个月,肿瘤坏死组的死亡风险度是无坏死组的1.85倍,坏死组的中位生存期是41个月,非坏死组的中位生存期是53个月。2.多因素分析:术后复发、WHO分级、CRNDE表达水平及肿瘤坏死对胶质瘤患者的预后有影响,可以作为影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)。这几项因素的死亡风险度分别是3.33、4.32、1.59及1.76倍。第三部分CRNDE对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响目的:探讨CRNDE对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移及其对相关基因表达的影响。方法:设计针对CRNDE的siRNA(si783和si809),转染人胶质瘤U251细胞株,并进行下列检测:1.细胞增殖检测:siRNA(si783和si809)转染人胶质瘤U251细胞株,并同时设置空白组及对照组,取12h,24h,48h三个时间点进行检测,CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖活性,并绘制出增殖曲线。2.细胞凋亡检测:利用PE Annexin-fitc染色方法,将siRNA(si783和si809)、对照(NC)组及空白组(NT)的U251细胞利用流式细胞法检测细胞凋亡比例。3.细胞迁移检测:通过Transwell小室进行细胞迁移实验分析下调CRNDE的表达对脑胶质瘤细胞迁移能力的影响。4.用SYBR GreenⅠReal-time PCR方法检测干扰siRNA(si783和si809)转染人胶质瘤U251细胞后相关基因(Raf-1、MEK-2、ERK-1、ERK-2、c-Myc、NF-κB)mRNA转录水平的变化情况。结果:1.CCK-8检测结果:干扰组、空白组和对照组细胞在0小时450nm处吸光度相同。转染12h后RNA干扰组(si783)(0.43±0.02)与对照组(0.52±0.006)细胞450nm处吸光度有统计学差异(P<0.05),与空白组(0.52±0.02)之间无显著差异(P>0.05);转染24h时干扰组(si783)(0.49±0.01)细胞450nm处吸光度显著低于对照组(0.65±0.016)和空白组(0.65±0.04)(P<0.05),对照组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。转染48h时干扰组(si783)(0.59±0.01)细胞450nm处吸光度显著低于对照组(0.72±0.01)和空白组(0.72±0.006)(P<0.05),对照组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。转染12h后RNA干扰组(si809)(0.46±0.004)与对照组(0.52±0.006)细胞450nm处吸光度有统计学差异(P<0.05),与空白组(0.52±0.02)之间无显著差异(P>0.05);转染24h时干扰组(si809)(0.52±0.02)细胞450nm处吸光度显著低于对照组(0.65±0.016)和空白组(0.65±0.04)(P<0.05),对照组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。转染48h时干扰组(si809)(0.62±0.01)细胞450nm处吸光度显著低于对照组(0.72±0.01)和空白组(0.72±0.006)(P<0.05),对照组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。2.流式细胞法检测细胞凋亡:RNA干扰组si783和si809的细胞凋亡比例分别为(19.2±1.6)%和(14.5±1.4)%,显著高于空白组(1.6±0.15)%及对照组(2.7±0.25)%(P<0.05),空白对照组与转染对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。3.细胞迁移实验:转染后RNA干扰组(si783和si809)的细胞计数分别为(287.2±28.6)和(351.6±16.9)均低于空白组(518.2±29.9)和对照组(471.6±29.4)(P<0.05),空白组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。4.RNA干扰后相关基因表达:Raf-1、MEK-2、ERK-1、ERK-2、c-Myc、NF-κB的mRNA表达量均有不同程度下降。其中Raf-1基因表达水平在si783组和si809组中分别下降为对照组的31.7%和72.2%;MEK-2基因表达水平分别降低为对照组的31.3%和41.9%;ERK-1基因表达水平分别降至对照组的60.4%和48.2%;ERK-2基因表达水平分别降至对照组的75.3%和70.4%;与对照组相比,si783和si809组中NF-κB表达水平分别降至对照组的39.9%和69.4%,c-Myc表达水平分别降至对照组的36.1%和47.3%。结论:1.CRNDE在人脑胶质瘤组织中的表达较瘤旁组织显著升高,且其表达水平与胶质瘤病理级别有关,高级别脑胶质瘤的表达要高于低级别脑胶质瘤,差异具有显著性。2.CRNDE的表达水平与胶质瘤的病理级别、肿瘤直径及肿瘤复发之间有正相关性(P<0.05),而与患者性别、年龄等因素无相关性。3.脑胶质瘤患者术后复发、高级别肿瘤、CRNDE高表达及肿瘤出现坏死的患者生存时间短。4.脑胶质瘤患者术后复发、病理级别、CRNDE表达水平、肿瘤坏死情况这四项因素可以作为影响患者预后的独立危险因素。5.抑制CRNDE可抑制胶质瘤细胞增殖及迁移,促进胶质瘤细胞的凋亡。6.CRNDE可能通过调节MAPK/ERK通路中Raf-1、MEK-2、ERK-1、ERK-2基因及转录因子c-Myc、NF-κB的表达来影响胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力。