Salirasib诱导K562细胞凋亡及其作用机制的研究

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目的:  观察RAS抑制剂Saliasib(FTS)诱导白血病细胞株K562生长抑制和凋亡作用,并探讨抗白血病可能的作用机制,为临床提供理论依据。  方法:  一、细胞培养  K562细胞复苏后常规培养于含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液中,置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。2~3天换液传代一次,取对数生长期细胞为实验对象。  二、CCK-8法检测FTS对K562细胞的增殖情况  实验分为二个组,不加药对照组、实验组(20.0、40.0、80.0、100μmol/LSaliasib),在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养12、24、48小时。应用CCK-8法检测不同浓度的FTS、不同时间作用细胞后的增殖情况。  三、AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率  分别收集不加药对照组、40.0μmol/LSaliasib组,80.0μmol/LSaliasib组处理24、48小时的细胞应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。  四、DAPI染色荧光显微镜观察细胞核形态  分别收集不加药对照组、20.0μmol/LSaliasib组、40.0μmol/LSaliasib组,80.0μmol/LSaliasib组处理24小时的细胞,经DAPI染色后荧光显微镜下观察细胞核形态学改变,进行图像采集。  五、用半定量RT-PCR分析细胞内Caspase-3,Survivin mRNA的基因表达水平  分别收集不加药对照组、40μmol/LSaliasib组、80μmol/LSaliasib组处理48小时的细胞,提取细胞总RNA,反转录得到对应的cDNA,应用RT-PCR分析细胞内Caspase-3,SurvivinmRNA的基因表达水平。  结果:  一、在一定药物浓度范围内,Saliasib能显著抑制K562细胞的生长。20.0、40.0、80.0,100μmol/LSaliasib处理细胞12小时增殖抑制率分别为(12.01±1.86)%、(16.45±3.22)%、(23.84±0.51)%、(27.66±2.08)%,处理24小时增殖抑制率分别为(24.90±0.42)%、(37.10±2.14)%、(43.80±1.07)%、(51.29±1.52)%,处理48小时增殖抑制率分别为(32.47±2.16)%、(44.26±2.24)%、(49.17±2.15)%、(62.65±0.89)%。在相同时间下,不同浓度的FTS组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。  二、Saliasib可诱导K562细胞凋亡,其作用呈浓度依赖性。40.0、80.0μmol/L,Saliasib处理24h,凋亡率分别为42.38±1.03%、72.14±0.12%;40.0、80.0μmol/LSaliasib处理48h,凋亡率分别为62.76±1.40%、82.30±1.01%。与相同时间对照组比较差异有统计学差异(P<0.05)。  三、荧光显微镜观察不同浓度Saliasib作用K562细胞24小时后各组出现细胞核染色质逐渐浓缩、高度凝集及边缘化,可见核碎片,细胞呈凋亡征象.  四、Saliasib对K562细胞caspase-3、SurvivinmRNA表达的影响:RT-PCR检测结果显示,Saliasib浓度为0μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的各处理组作用K562细胞48h后,SurvivinmRNA的相对表达量分别为1±0.00,0.45±0.07,0.32±0.06随着Saliasib浓度增加,SurvivinmRNA的相对表达量逐渐降低,差异具有显著性(P<0.05)。caspase-3mRNA的相对表达量分别为1±0.00、1.79±0.12,2.09±0.09随着Saliasib浓度增加,caspase-3mRNA的相对表达量逐渐增高,差异具有显著性(P<0.05)。  结论:  1.Saliasib可诱导K562细胞发生凋亡,从而抑制细胞的生长,具有剂量及时间依赖关系。  2.Saliasib使K562细胞发生凋亡,且凋亡率在一定范围内呈浓度依赖性及时间依赖性。  3、Saliasib通过抑制Survivin mRNA的表达,增强caspase-3 mRNA的表达,促进K562细胞凋亡。
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