目的:　　 本研究成功构建了hTERT启动子控制腺病毒EIA表达、HRE启动子控制EIB表达并携带人内皮抑素基因的基因-病毒治疗系统AdTPHre-hEndo,通过体外实验初步探讨对胰腺癌的治疗作用。　　 方法:　　 1.基因-病毒治疗系统AdTPHre-hEndo的构建和制备　　 (1)通过基因重组技术构建受端粒酶逆转录酶启动子控制腺病毒E1A表达、缺氧反应元件启动子控制E1B表达并携带人内皮抑素基因的质粒pTPHre-hEndo。　　 (2)将质粒pTPHre-hEndo与含有腺病毒右臂的质粒pBGHE3共转染至293细胞中同源重组得到带抗肿瘤基因的双重调控增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo。病毒在293细胞中反复扩增到需要量,氯化铯梯度离心法纯化后冻存备用。50％组织培养感染剂量(TCID50)方法测定病毒滴度。　　 2.体外实验　　 (1)病毒增殖实验:用AdTPHre-hEndo分别感染胰腺癌细胞SW1990和AsPC-1及正常的胰腺细胞株CCC-HPE-2,计算出在各种细胞中的增殖倍数；　　 (2)病毒杀伤实验:采用四氮唑盐比色实验(MTT)法测定不同滴度的病毒AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015、野生型5型腺病毒(Wad5)对胰腺癌细胞和正常细胞的杀伤效应；　　 (3)E1A、E1B和治疗基因表达的检测及定量分析:利用Westem blot检测AdTPHre-hEndo对SW1990、AsPC-1和CCC-HPE-2感染后病毒蛋白E1A、E1B及目的基因的表达；ELISA检测人内皮抑素治疗基因的表达。　　 结果:　　 1.成功构建了由双重调控的基因-病毒治疗系统经PCR鉴定,证实重组正确,并命名为AdTPHre-hEndo；Western blot检测E1A、E1B和治疗基因表达的结果显示,在AdTPHre-hEndo感染的SW1990细胞中有E1A蛋白,模拟缺氧条件肿瘤细胞中有E1B蛋白表达,在病毒感染的肿瘤细胞上清液中hE阳性表达；　　 2.增殖实验结果证实AdTPHre-hEndo可以选择性地在端粒酶阳性的胰腺癌细胞中增殖。AdTPHre-hEndo在SW1990和AsPC-1中的增殖倍数分别是(2140±183)和(2876±112),分别是在正常CCC-HPE-2细胞增殖倍数的1132倍和1522倍；ONYX-015在中SWl990和AsPC-1的增殖倍数分别是(973±130)和(1055±72),AdTPHre-hEndo在两种胰腺癌细胞株中的增殖倍数明显高于ONYX-015(P<0.01)；而Ad-hEndo在3种细胞株中均无明显的增殖；　　 3.AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015、Wad5感染胰腺癌细胞杀伤的半数有效量(ED50)分别是MOI=0.624、MOI>100、MOI=0.781和MOI=0.284；感染正常细胞时Wad5的ED50为MOI=0.945,余三种病毒均为MOI>100；　　 4.ELISA检测结果显示随着感染时间的延长,肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加,明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hEndo(P<0.001)。　　 结论:　　 1.本实验成功构建了hTERT启动子控制腺病毒E1A表达、HRE启动子控制E1B表达并携带人内皮抑素基因的基因一病毒治疗系统AdTPHre-hEndo；　　 2.AdTPHre-hEndo具有体外条件下在胰腺癌细胞中特异性增殖并杀灭胰腺癌细胞的能力；　　 3.AdTPHre-hEndo所携带的治疗基因在胰腺癌细胞中的表达因病毒的增殖而得到了特异性的放大；　　 4.AdTPHre-hEndo与ONYX-015和Ad-hEndo相比,具有更强的抑制胰腺癌细胞生长的能力,肿瘤增殖病毒的抗肿瘤效能因携带抗癌基因而得到了增强。为胰腺癌的生物治疗提供了一种新的策略。