论文部分内容阅读
CD82是抑癌基因KAI1编码的细胞膜糖蛋白,属于四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily or tetraspan superfamily,TM4SF)成员之一,其主要生物学功能是参与细胞的聚集、粘附、迁移等。CD82在正常机体组织广泛表达,在肿瘤组织表达下降。大量研究结果表明,CD82可抑制多种组织来源的肿瘤细胞在体内的转移,是广谱的肿瘤转移抑制因子。CD82抑制肿瘤转移机制的研究日益受到重视,但其详细分子机理仍不完全清楚。CD82由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成,跨膜区为四个疏水的肽段,胞外区形成一个小环(small extracellular loop,SEL)和一个大环(large extracellular loop,LEL),胞内区包括N-端、C-端和一个细胞内环。分子结构是蛋白发挥功能的基础,胞外区结构域是CD82直接与细胞外基质分子及其它细胞相互识别、结合及相互作用的部位,是CD82发挥生理功能的重要结构基础。对CD82蛋白胞外区结构域功能进行研究,可阐明其抑制肿瘤转移的分子机理。目前,对CD82的胞外区功能研究较少,尤其是胞外区SEL功能尚不明确。为研究CD82胞外结构域在CD82抑制肿瘤转移中的作用,本论文采用基因重组技术和化学合成方法得到了CD82-LEL序列模拟肽和CD82-SEL序列模拟寡肽,进行了以下几个内容的研究。一、CD82胞外区序列模拟肽段对肿瘤细胞迁移的影响。CD82抑制肿瘤细胞转移的主要机理是抑制细胞的运动和迁移能力。采用划痕法、Boyden小室培养法对CD82-LEL和CD82-SEL序列模拟肽段体外抑制肿瘤细胞迁移作用进行了观察。结果:采用基因重组技术和化学合成方法获得了CD82-LEL序列模拟肽和CD82-SEL序列模拟寡肽。CD82-LEL序列模拟肽对SW620肿瘤细胞的体外迁移和侵袭无明显抑制作用,而CD82-SEL序列模拟寡肽对SW620肿瘤细胞的体外迁移和侵袭有抑制作用,处理浓度越大抑制作用越强。结论:cd82-lel序列模拟肽在体外不能抑制细胞的运动和迁移,而cd82-sel序列模拟寡肽抑制体外培养的细胞的运动和迁移,随处理浓度增大抑制作用增强。说明,cd82-sel可能是cd82抑制肿瘤转移的重要功能结构域。二、cd82胞外区序列模拟肽段对肿瘤细胞与不同细胞外基质分子识别、粘附的影响。cd82胞外结构域直接参与细胞与细胞外基质间的识别、结合,因此,是cd82参与细胞迁移、运动的重要结构,也是其肿瘤转移抑制作用的重要功能部位。在这部分,我们观察了cd82-lel序列模拟肽和cd82-sel序列模拟寡肽对sw620肿瘤细胞与层粘连蛋白(laminin,ln)、纤粘连蛋白(fibronectin,fn)、基质胶(matrigel)粘附的影响。结果:cd82-lel序列模拟肽对sw620肿瘤细胞与ln、fn、matrigel的粘附无明显抑制作用,而cd82-sel序列模拟寡肽对sw620肿瘤细胞与ln、fn、matrigel的粘附有明显抑制作用,且其抑制能力与处理浓度呈正相关。结论:cd82-lel序列模拟肽不能独自参与肿瘤细胞与细胞外基质的识别、粘附,或由失去糖链结构而致;cd82-sel序列模拟寡肽具有抑制肿瘤细胞与细胞外基质的识别、粘附作用,这可能与cd82-sel序列模拟寡肽抑制肿瘤细胞的迁移运动有关。三、cd82-sel序列模拟寡肽影响整合素与细胞外基质分子之间的相互作用。分布于细胞表面的粘附分子中,只有整合素的配体是细胞外基质分子,包括fn、ln、玻璃粘连蛋白(vitronecin,vn)和胶原蛋白(collagen,ca)等。所以只有整合素才是介导细胞与细胞外基质接触结合的粘附分子。有文献报道,cd82可抑制整合素与ln的结合,并发现cd82在细胞表面常与整合素、生长因子受体及其他四跨膜家族蛋白结合成复合体而发挥作用。为探讨cd82-sel序列模拟寡肽抑制细胞的运动和迁移以及抑制细胞与细胞外基质粘附的分子机制,我们对整合素在cd82-sel序列模拟寡肽抑制肿瘤细胞与细胞外基质的识别、粘附过程中的作用进行了初步研究。结果:(1)采用westernblot技术检测了不同类型整合素亚基在sw620肿瘤细胞的表达图谱。结果显示,sw620细胞可表达α3、α4、α5、α6、β1、β3亚基。(2)细胞外基质分子ln刺激sw620细胞整合素α3、α6、β1亚基的表达,FN刺激SW620细胞整合素α4、α5、β1亚基的表达,Matrigel刺激SW620细胞整合素α3、β1亚基的表达。(3)CD82-SEL序列模拟寡肽可分别抑制LN、FN和Matrigel刺激的SW620细胞整合素α3、α4、α5、α6、β1亚基的表达。其抑制作用随处理浓度增加而增强。(4)整合素α3、α6、β1亚基可与LN结合,α4、α5、β1亚基可与FN结合,α3、β1亚基可与Matrigel结合。(5)CD82-SEL序列模拟寡肽抑制整合素亚基与细胞外基质分子LN、FN、Matrigel识别、结合。结论:CD82-SEL序列模拟寡肽既可抑制细胞外基质分子刺激SW620细胞整合素亚基的表达,又可抑制整合素与细胞外基质分子LN、FN、Matrigel直接结合。从而抑制细胞对细胞外基质分子的识别粘附。四、CD82-SEL序列模拟寡肽对SW620细胞粘着斑激酶酪氨酸残基磷酸化的影响。粘着斑激酶(FAK)是整合素所介导的细胞信号转导通路中的关键蛋白激酶。整合素与其配体结合以及粘着斑的形成使FAK磷酸化活化,调节细胞的生长、增殖、分裂及迁移运动。为探讨CD82-SEL序列模拟寡肽对SW620细胞运动、迁移的抑制机理,我们进一步观察了CD82-SEL序列模拟寡肽对SW620细胞FAK酪氨酸残基磷酸化的影响。结果:(1)采用Western Blot技术检测了SW620肿瘤细胞FAK各位点酪氨酸残基磷酸化情况。结果显示,SW620细胞FAK的397、407、576、577、861、925位酪氨酸残基均发生磷酸化。(2)细胞外基质分子LN、FN、Matrigel可刺激SW620细胞FAK的397、407和861位酪氨酸残基磷酸化,不影响FAK的925位酪氨酸残基磷酸化。(3)CD82-SEL序列模拟寡肽抑制细胞外基质分子LN、FN、Matrigel对SW620细胞FAK的397、407和861位酪氨酸残基磷酸化的刺激作用。结论:CD82-SEL序列模拟寡肽通过抑制SW620肿瘤细胞整合素与其细胞外配体结合,从而抑制FAK的磷酸化活化。可能是其抑制肿瘤细胞迁移运动的重要机制之一。