西维因降解菌的分离鉴定、生物学特性及其水解酶基因cehA的克隆

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西维因是一种中等毒性的氨基甲酸酯类杀虫剂,广泛用于果树、蔬菜、粮食、药材、茶等141种作物中,可防止565种害虫。其杀虫作用机制为抑制害虫神经传导的重要物质-乙酰胆碱酯酶(AChE)。西维因大面积、持续地使用,其在环境中的残留已对人类健康和生态环境的平衡产生潜在的威胁。以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物去除方法。本研究从某生产西维因农药的工厂的废水处理系统污泥中分离筛选到两株西维因降解菌FX-1和X9。根据其形态、生理生化特性及16S rRNA基因序列相似性比较,将FX-1和X9初步鉴定为Sphingobium sp.和Rhizobium sp..菌株FX-1和X9的最适生长温度均为30℃;最适生长pH均为7.0;最适生长NaCl浓度分别为5g.L-1和10g·L-1; FX-1和X9的最适生长碳源均为葡萄糖;最佳无机氮源分别为硫酸铵和硝酸铵;它们均对链霉素有抗性。菌株FX-1和X9能够以西维因为唯一碳源生长,分别在6h和4h内完全降解34mg·L-1的西维因,FX-1和X9降解西维因的最适温度分别为30℃和37℃;最适pH分别为8.0、9.0;通气量对菌株FX-1降解西维因影响较大,而对菌株X9降解西维因的影响不明显;菌株X9能够以西维因的水解产物1-萘酚为唯一碳源生长,可以在16h内完全降解34mg·L-1的1-萘酚,并且接种量越大,其降解1-萘酚的延滞期越短;X9降解1-萘酚的最适温度为30℃;最适pH为7.0;通气量越大,降解速率越快;能较好的降解20-200mg·L-1的1-萘酚。根据已报道的西维因降解相关基因设计引物,从X9中扩增出cehA基因。通过在线比对序列相似性,在核苷酸水平上它们与西维因降解菌AC100的cehA基因相似性为99%。将cehA基因构建到表达载体pET32a中,在E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行了表达,得到了分子量符合预期大小的蛋白质(85KDa),该蛋白具有西维因水解酶活性。
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