脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)属于小核糖核酸病毒科心病毒属,是一种无包膜单股正链RNA病毒。EMCV不仅可引起心肌炎和脑炎,还可引起多种哺乳动物的神经系统疾病、生殖障碍和糖尿病。EMCV宿主范围广,猪是其易感动物,可引发仔猪急性心肌炎和妊娠母猪胎儿死亡或流产,给我国养殖业带来很大经济损失。然而,不同毒株EMCV毒力和致病性存在显著差异,其致病机制尚不完全清楚,同时在该病的防控中也亟需相关生物制剂的研发。本研究对猪源EMCV HLJ株感染小鼠的致病性进行了系统的研究,鉴定病毒的生长特性后接种5周龄雌性小鼠,观察感染小鼠的临床症状和病理变化。感染小鼠在在第3 d开始出现临床症状,表现为眼结膜红肿出血,后肢瘫痪、震颤、转圈等神经症状,并在出现症状后发生死亡。感染后3-7 d小鼠脑充血肿胀,心脏组织变软,可见点状或弥散的白色坏死灶。病理组织学检查表明感染后3-7 d小鼠大脑可见充血、出血,神经元变性和坏死而数量减少,小胶质细胞浸润,在血管周围形成“血管套”现象;心脏可见心肌细胞变性坏死,心肌纤维崩解后溶解消失,炎性细胞弥散性分布。实时荧光定量PCR方法对病毒在各脏器组织中的分布进行检测,表明病毒在感染后3-5 d达到高峰,其中脑和心脏的病毒载量最高。间接免疫荧光检测方法对主要器官中的病毒进行定位,脑和心脏中检测到强荧光信号,脑神经元细胞和心脏心肌纤维中病毒呈高水平分布。病毒在各器官组织中的分布与其病理损伤呈正相关性。EMCV HLJ株的主要靶器官为小鼠脑和心脏。同时,开展了猪源EMCV HLJ株感染性c DNA克隆的构建和病毒拯救,通过RT-PCR方法分段扩增EMCV HLJ株的基因组,再通过overlap PCR方法将各个片段融合获得完整的c DNA,经酶切后将全基因组PCR产物与p CI载体连接转化后获得全长c DNA感染性克隆。在引物D2-F和D1-R中引入点突变,突变后形成的Eco R I酶切位点作为感染性克隆的分子标志。之后通过DNA转染技术将p CI-HLJ重组质粒转入BHK-21细胞中并获得拯救病毒,命名为r HLJ。拯救病毒在BHK-21细胞上产生典型细胞病变,细胞皱缩,变圆脱落,呈葡萄籽样,其生长特性与亲本病毒相似。此外,通过RT-PCR方法扩增拯救病毒D片段进行Eco R I单酶切鉴定,以及扩增含有分子标志病毒基因组5958-6401 nt区域进行测序鉴定,结果表明r HLJ中含有Eco R I酶切位点。间接免疫荧光检测表明拯救病毒接种BHK-21细胞可见绿色荧光信号,表明病毒拯救成功。EMCV HLJ株感染性c DNA克隆的获得为该病毒基因功能研究和基因工程疫苗研发提供了重要的物质基础。