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目的:筛选核受体家族中对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)增强子或核心启动子转录活性有影响的基因,初步研究生殖细胞核因子(germ cell nuclear factor,NR6A1)对HBV转录与复制的调控作用。方法:(1)以人源性肝癌细胞系HepG2 m RNA为模板反转录得到的cDNA为模板,克隆得到带有核受体家族基因的表达质粒。(2)构建海肾荧光素酶报告质粒pcore-Rluc。(3)通过核受体基因表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒pcore-Rluc共转染,转染后对荧光素酶活性的检测,筛选对增强子或核心启动子转录活性有影响的核受体基因。(4)构建核心启动子或增强子的缺失突变体质粒,将NR6A1与缺失突变体质粒共转染,鉴定NR6A1的作用部位。(5)在HepG2细胞共转染HBV1.3倍体质粒与NR6A1表达质粒;通过Western blot检测NR6A1蛋白表达的情况,通过Southern blot检测细胞内复制的HBV DNA;通过Northern blot检测HBV RNA的转录情况。(6)构建NR6A1的截变体表达质粒,鉴定NR6A1的关键作用区域。结果:(1)以人源性肝癌细胞系HepG2 m RNA为模板反转录得到的cDNA为模板,成功扩增和克隆得到8种核受体基因。(2)通过核受体基因表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒pcore-Rluc共转染,筛选出对HBV增强子/核心启动子活性有明显影响的基因NR6A1。(3)NR6A1显著降低pcore-Rluc所表达的荧光素酶活性,与对照组(空载和pcore-Rluc共转染)相比,使Rluc活性下降约5倍(对照组为1.000±0.319,NR6A1组为0.198±0.009)(q=31.19,P=0.000)。(4)成功构建了pcore-Rluc截短突变体质粒PCH9-1744-Rluc(BCP)、PCH9-1636-Rluc(BCP+Enh II)、PCH9-1635/1747-Rluc(BCP+Enh I)。(5)pcore-Rluc截短突变体质粒与NR6A1共转染,通过对荧光素酶活性的检测,发现PCH9-1635/1747-Rluc(BCP+Enh I)实验组荧光素酶活性相对于对照组(空载和PCH9-1635/1747-Rluc共转染)无显著变化(t=1.018,P=0.367);NR6A1能降低PCH9-1744-Rluc所表达的荧光素酶活性,实验组(PCH9-1744-Rluc和NR6A1共转染)荧光素酶活性相对值(0.504±0.023)相对于对照组(空载和PCH9-1744-Rluc共转染)(1.000±0.099)下降了约50%(t=6.534,P=0.0226);NR6A1能降低PCH9-1636-Rluc所表达的荧光素酶活性,实验组(PCH9-1636-Rluc和NR6A1共转染)荧光素酶活性相对值(0.,089±0.002)相对于对照组(空载和PCH9-1636-Rluc共转染)(1.000±0.042)下降了约92%(t=31.59,P=0.001)。(6)成功构建了3×flag-NR6A1表达质粒,将3×flag-NR6A1表达质粒与HBV1.3共转染后,通过Western blot检测到3×flag-NR6A1蛋白表达。通过Southern blot检测到实验组(HBV1.3和3×flagNR6A1共转染)相对于对照组(HBV1.3和空载共转染)的HBV DNA复制水平显著降低(P=0.000)。通过Northern blot检测到实验组(HBV1.3和3×flag-NR6A1共转染)相对于对照组(HBV1.3和空载共转染)的HBV RNA水平显著降低(P=0.004)。(7)成功构建了NR6A1截短突变体质粒NR6A1DBD、NR6A1LBD、NR6A1N、NR6A1C。(8)pcore-Rluc分别与NR6A1截短突变体质粒NR6A1DBD、NR6A1LBD和PACI(阴性对照)、NR6A1(阳性对照)共转染HepG2细胞,海肾荧光素酶活性检测结果显示,所有组进行比较有差异(F=21.494,P=0.006),NR6A1DBD+pcore-Rluc、NR6A1LBD+pcore-Rluc荧光素酶活性相对值相对于阴性对照组(PACI和NR6A1共转染)(1.000±0.228)无显著变化,其荧光素酶活性相对值分别为1.011±0.070(P>0.05),0.900±0.017(P>0.05)。pcore-Rluc分别与NR6A1N、NR6A1C的两种截变体共转染HepG2细胞,海肾荧光素酶活性检测结果显示,NR6A1N、NR6A1C荧光素酶活性相对值相对于阴性对照组(NR6A1和ACB共转染)1.150±0.141无显著变化,其荧光素酶活性相对值为1.000±0.170(P>0.05)。NR6A1C荧光素酶活性相对值相对于阴性对照组(NR6A1和pcore-Rluc共转染)(1.150±0.141)无显著变化,其荧光素酶活性相对值为1.160±0.078,(P>0.05)。结论:(1)从8种核受体家族成员中,筛选到对乙肝病毒核心启动子和增强子活性具有显著抑制作用的因子NR6A1。(2)NR6A1过表达能抑制乙肝病毒的转录与复制。(3)核心启动子和增强子II是NR6A1作用的关键部位。(4)NR6A1的DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)不能单独起作用,需要铰链区存在才能发挥对乙肝病毒核心启动子和增强子活性的抑制作用。