背景：近年来有关microRNA(miRNA)方面的研究多且涉及的领域广，其中在肿瘤方面也成为研究的热点之一。miRNA是一类主要存在于真核生物细胞中内源性非编码小分子RNA，长度约18-24个核苷酸，主要通过和靶基因3,UTR的配对来影响靶基因的作用，进而调节细胞的增值、分化、凋亡及肿瘤的形成和转移等一系列的重要生物学过程。我们的前期临床研究也发现，miR-22在结直肠癌肿瘤组织中表达下调，低表达miR-22与患者肝转移有关，并且低表达miR-22患者预后较差。Sp1是一种转录调控因子，具有序列特异性的DNA结合蛋白，在结直肠癌细胞生长及转移中发挥着重要的作用。研究表明Sp1在结直肠癌中表达异常升高，且异常高表达 Sp1可以促进结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移。　　PTEN是人体中重要的抑癌基因，而且我们前期的研究也发现，PTEN在结直肠癌细胞的生长及转移中起抑制作用。既往研究证实，PTEN主要是通过阻断AKT信号通路从而抑制肿瘤的生长及转移。另外，大量有关肿瘤方面的研究表明miR-22与PTEN呈正相关。鉴于miR-22、Sp1及PTEN均在结直肠细胞生长和转移中起重要调控作用，且研究发现在乳腺癌中miR-22/Sp1之间存在负反馈环路，因此我们推测miR-22/Sp1在结直肠癌中可能存在负反馈环路，进而通过抑制PTEN促进AKT磷酸化，进一步影响结直肠癌细胞的生长及转移，但是目前尚未有文献报道。　　目的：检测miR-22在结直肠癌组织、肝转移组织及细胞中的表达；研究miR-22对结直肠癌细胞在体内外生物学特性的影响及miR-22和Sp1在结直肠癌细胞中的相互作用；研究miR-22对信号通路PTEN/AKT的影响。通过上述研究证实MicroRNA-22/Sp1负反馈环路调控结直肠癌细胞生长和转移的作用机制，为miR-22成为治疗结直肠癌新的靶基因提供理论依据。　　方法：　　1.检测miR-22在结直肠癌组织、正常组织、肝转移组织及结直肠癌细胞中的表达结直肠癌患者癌组织、癌旁正常组织和肝转移组织中miR-22的表达及结直肠癌细胞株SW480、SW620、HT-29、LoVo和Caco-2中miR-22的表达均采用荧光定量RT-PCR法检测。　　2.miR-22对结直肠癌细胞体内和体外生物学特性的影响　　（1）利用Lipofectamine2000转染,制备过表达和表达抑制miR-22的SW620及LoVo细胞株，同时制备过表达和表达抑制anti-miR-22的SW480及HT-29细胞株。利用慢病毒转染制备稳定过表达miR-22的SW620细胞株。　　（2）miR-22过表达或表达抑制后，用MTT实验检测CRC细胞的生长增值能力，平板克隆形成实验检测CRC细胞的克隆形成能力，Transwell迁移及侵袭实验检测CRC细胞的侵袭及迁移能力。　　（3）利用慢病毒转染制备稳定过表达miR-22的SW620细胞株。经裸鼠皮下成瘤实验和转移瘤实验来了解miR-22过表达对裸鼠体内结直肠癌细胞成瘤及远处转移能力的影响。　　3.miR-22靶基因Sp1的证实　　（1）利用TargetScan、Pictar和MiRanda生物信息学基因在线预测软件预测miR-22的靶基因。　　（2）利用westernblot、qRT-PCR检测转染miR-22/miR-nc的SW620细胞株及转染anti-miR-22/anti-miR-nc的SW480细胞株Sp1 mRNA及蛋白的表达情况，明确miR-22对Sp1的表达的影响。　　（3）利用双荧光素酶报告载体系统检测miR-22与Sp13，UTR的结合情况，明确Sp1是否为miR-22直接作用的靶基因。　　（4）回复实验进一步证实miR-22与Sp1之间的相互作用。将SW620和LoVo细胞株转染miR-22/miR-nc/miR-22+Sp1/Sp1，再次利用细胞功能实验检测miR-22过表达、Sp1过表达及miR-22和Sp1共表达对体外结直肠癌细胞生长、克隆形成及侵袭迁移能力的影响。　　4.miR-22/Sp1负反馈机制的证实　　（1）利用生物信息学在线预测软件TRAVSFAC、JASPAR和 PROMO预测miR-22启动子上转录因子的结合位点。　　（2）将SW480及HT-29细胞株转染Sp1、siSp1及其阴性对照,利用qRT-PCR检测miR-22表达情况，明确Sp1对miR-22的表达的影响。　　（3）利用双荧光素酶报告载体系统，在SW480细胞及HT-29细胞中检测转录因子Sp1是否直接作用于miR-22启动子序列。　　（4）免疫共沉淀实验证实转录因子Sp1与miR-22启动子的直接结合位点。　　（5）回复实验进一步证实miR-22与Sp1之间的相互作用，将SW480和HT-29细胞株转染Sp1/vector/Sp1+miR-22，再次检测miR-22和Sp1共表达及 Sp1过表达对体外结直肠癌细胞增值、克隆形成及侵袭迁移能力的影响。　　5.miR-22通过抑制Sp1的表达，从而作用于信号通路PTEN/AKT的证实　　（1）利用生物信息学在线预测软件TRAVSFAC、JASPAR和PROMO预测PTEN启动子上转录因子的结合位点。　　（2）利用westernblot检测miR-22过表达、miR-22表达抑制及miR-22/Sp1共表达后SW480及SW620细胞株中p-AKT、T-AKT及PTEN蛋白质的表达情况。　　（3）利用双荧光素酶报告载体系统明确Sp1是否直接作用于PTEN。　　6.统计学分析采用IBM SPSS19.0统计软件统计分析数据。采用配对样本T检验或者U检验分析比较定量资料，采用卡方检验分析比较定性资料。术后生存率的分析用Kaplan-Meier法，之间的差异采用时序检验（log-rank test）。P＜0.05做为差异具有统计学意义。　　结果：　　1.miR-22在结直肠癌组织、细胞中表达下调，并且其表达量与结直肠癌的TNM分期、淋巴结转移及复发转移相关　　（1）在结直肠癌组织中miR-22表达降低：结直肠癌组织中miR-22的表达明显低于正常的肠粘膜组织（P＜0.05）,有76%(118例中有83例)的癌组织样本 miR-22的表达比正常肠粘膜组织降低了4倍以上。miR-22的表达随肿瘤TNM分期的增加而逐渐降低（P＜0.05）；伴有淋巴结转移的患者miR-22的表达较不伴有淋巴结转移的低（P＜0.05）。　　（2）肝脏转移组织中 miR-22表达比原发结直肠癌组织中低（P＜0.05）。　　（3）miR-22在高转移潜能的细胞株中表达下调：在高转移潜能的细胞株SW620及LoVo中miR-22的表达较低转移潜能的SW480、HT-29及Caco-2细胞株中低（P＜0.05）。　　（4）miR-22表达低的患者更容易出现术后复发转移：经外科手术根治性切除的110例I-III期CRC患者随访五年，有31例（28.2%）出现术后复发转移。miR-22低表达患者术后复发转移的风险高（P＜0.05）。用Kaplan-Meier生存分析同样提示miR-22低表达患者术后更容易出现复发转移而死亡。　　2.miR-22抑制结直肠癌细胞在体内外生长和转移　　（1）在体外结直肠癌细胞中miR-22可抑制其生长增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力：SW620和LoVo细胞转染miR-22/miR-nc，SW480和HT-29细胞转染anti- miR-22/anti-miR-nc。细胞功能实验（MTT、平板克隆形成、侵袭和迁移）结果显示：miR-22过表达后细胞生长、克隆形成、侵袭及迁移能力降低(P＜0.05)，而miR-22表达抑制后细胞生长、克隆形成、侵袭及迁移能力升高(P＜0.05)。　　（2）裸鼠皮下成瘤实验显示：SW620/miR-22组皮下瘤体积小于SW620/Control组(P＜0.05)。　　（3）转移瘤实验显示：SW620/miR-22组中有6/6例出现肺转移，SW620/Control组中6/6例出现肺转移，但SW620/Control组与SW620/miR-22组比较显示转移瘤个数多且体积大。　　3.Sp1是miR-22的靶基因　　（1）利用生物信息学基因在线预测软件TargetScan、Pictar和MiRanda预测显示Sp1是miR-22的靶基因之一。　　（2）westernblot检测转染miR-22/miR-Nc的SW620细胞株及转染anti-miR-22/anti-miR-Nc的SW480细胞株Sp1的表达情况，结果显示：SW620细胞转染miR-22后Sp1表达水平下调（P＜0.05），SW480细胞转染anti-miR-22后Sp1表达水平上调（P＜0.05），提示miR-22在细胞中可以抑制Sp1的表达。　　（3）成功构建WtSp13，UTR和MutSp13，UTR双荧光素酶报告载体。将WtSp13，UTR和MutSp13，UTR以及miR-22/anti-miR-22共转染至HEK293TT细胞中。在miR-22存在的情况下，WtSp13，UTR的荧光素酶活性下降（P＜0.05），在anti-miR-22存在的情况下，WtSp13，UTR的荧光素酶活性升高（P＜0.05），而在MutSp13，UTR双荧光素酶活性均无明显变化，这表明miR-22可以特异的结合Sp13，UTR。　　（4）miR-22通过作用于靶基因Sp1抑制CRC细胞生长和转移将SW620和LoVo细胞株转染miR-22/miR-nc/miR-22+Sp1/Sp1,细胞功能试验显示：转染miR-22可以抑制细胞的生长、克隆形成、侵袭及迁移能力，转染Sp1可以促进细胞的生长、克隆形成、侵袭及迁移能力。回复实验显示转染miR-22+Sp1后细胞的生长、克隆形成、侵袭及迁移能力介于转染miR-22和Sp1之间。　　4.Sp1通过抑制miR-22表达促进CRC细胞的生长和转移　　（1）利用生物信息学在线预测软件 TRAVSFAC、JASPAR和 PROMO预测miR-22启动子上转录因子的结合位点，发现存在Sp1的结合位点。　　（2）将SW480及HT-29细胞株分别转染Sp1/Nc和siSp1/siNc,利用QRT-PCR检测miR-22表达情况显示：转染Sp1后miR-22表达明显下调(P＜0.05)，而转染siSp1后miR-22表达明显上调（P＜0.05）。　　（3）在miR-22启动子序列区发现三个Sp1结合位点，我们将距离近的结合位点1、2定义为A位点并扩增，将结合位点3定义为B位点并扩增,构建野生型荧光素酶报告载体PGL3-Wt-Luc。双荧光素酶报告载体实验结果显示：Sp1可以降低PGL3-Wt-Luc的荧光素酶活性（P＜0.05),说明Sp1可以与miR-22启动子序列直接结合。　　（4）CHIP实验进一步证实Sp1可以直接结合于miR-22启动子序列的A位点。　　（5）Sp1通过作用于miR-22促进CRC细胞的生长和转移：将SW480和HT-29细胞株转染Sp1/vector/Sp1+miR-22，行细胞功能试验显示：与vector相比，转染Sp1后SW480和HT-29细胞生长、克隆形成、侵袭及迁移能力明显增强（P值均＜0.01），而转染Sp1+miR-22后SW480和HT-29细胞生长、克隆形成、侵袭及迁移能力强于转染vector组，但比转染Sp1组弱。　　5.miR-22通过靶向抑制 Sp1的表达，从而作用于信号通路PTEN/AKT　　（1）利用生物信息学在线预测软件 TRAVSFAC、JASPAR和PROMO预测PTEN启动子上转录因子的结合位点，发现存在Sp1的结合位点。　　（2）利用westernblot检测SW480及SW620细胞株miR-22过表达、miR-22表达抑制及 miR-22/Sp1共表达后p-AKT、T-AKT及PTEN蛋白质的表达。结果提示：miR-22过表达后PTEN表达升高，p-AKT表达降低,T-AKT表达无显著变化；miR-22表达抑制后PTEN表达降低，p-AKT表达升高,T-AKT表达无显著变化；miR-22/Sp1共表达后PTEN表达升高（水平介于miR-22过表达及miR-22表达抑制之间），p-AKT表达降低（水平介于miR-22过表达及miR-22表达抑制之间）,T-AKT表达无显著变化。　　（3）Sp1通过抑制PTEN的表达促进CRC细胞的生长和转移：双荧光素酶报告载体实验结果显示Sp1可直接作用于PTEN启动子序列。　　结论：　　1.miR-22在结直肠癌组织中表达下调；miR-22在肝转移组织中的表达比在原发肿瘤中低；miR-22在具有高转移潜能的细胞中表达下调；miR-22的表达与结直肠癌的TNM分期、淋巴结转移和术后复发有关。初步推断在结直肠癌中miR-22发挥抑癌作用。　　2.miR-22可以抑制结直肠癌细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭。　　3.Sp1为miR-22的靶基因。　　4.miR-22/Sp1通过双向负反馈机制调节结直肠癌细胞的生长和转移。　　5.miR-22通过靶基因Sp1作用于信号通路PTEN/AKT,抑制结直肠癌细胞生长和转移。