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带有强吸电子基团的光学纯缺电子烷烃类化合物是有机合成中的重要合成砌块,可以用来制备光学纯手性药物。碳碳双键还原酶(enoate reductase)不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键,能同时得到具有一个或两个手性中心的光学纯缺电子烷烃化合物,因此是用来广泛制备手性缺电子烷烃类的方法之一。
本论文主要从以下几方面进行研究:首先筛选能够转化目标底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸2a生成相应的γ-氨基丁酸关键手性前体的优良菌株;通过对活力菌株进行菌株鉴定选取新型产碳碳双键还原酶菌株,对筛出的新型优良菌株进行保藏;通过对新型优良菌株生物转化条件的研究,提高其转化目标底物生成相应烷烃化合物的活力;最后研究该新型优良菌株的底物适应性,以拓展碳碳双键还原酶在不对称合成中的应用,为化学催化过程提供一条互补的途径。
主要研究结果如下:(一)、本研究以柠檬醛和(Z)-2-苯基丁-2-烯腈为唯一碳源和能量来源富集土壤样品,成功的从生境中筛选出16株产碳碳双键还原酶菌株,其中7株能不对称催还还原目标底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸2a得到相应的γ-氨基丁酸关键手性前体(R)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸,获得了较好的转化率和ee值;(二)、通过16SrRNA分子生物学鉴定,菌株JA81被鉴定为一株无色杆菌属,目前尚无文献系统研究Achromobacter sp.应用于不对称催化还原碳碳双键,本文将其命名为无色杆菌属JA81(Achromobacter sp.JA81),并将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保减号为:CCTCCM2011369;(三)、利用Achromobacter sp.JA81休止细胞转化底物目标底物2a生成(R)-2b,菌株生物转化条件的研究结果显示,Achromobacter sp.JA81催化底物2a还原所需的碳碳双键还原酶属于组成型表达的酶,无需外加诱导剂诱导;最优的辅酶再生底物为生物反应体系中添加1%(w/v)的葡萄糖和5%(v/v)的异丙醇;生物转化时最适的温度和pH条件分别为30℃和7.0;(四)、该菌株能不对称催化还原不饱和硝基,不饱和酮,不饱和硝基酯,不饱和腈酸化合物和不饱和马来酰亚胺及衍生物,而且可获得最高对映体过量达到>99%,最高转化率达到100%。
总之,我们从土壤中成功筛选出一株新型产碳碳双键还原酶的菌株无色杆菌JA81;该菌株可以高活性、高立体选择性不对称催化还原(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸型底物得到相应的(R)3-芳基-3-氰基-丙酸;菌株还能不对称催化还原不饱和硝基,不饱和酮,不饱和硝基酯,不饱和腈酸化合物和不饱和马来酰亚胺及衍生物。