研究背景肾移植经过几十年的发展,已成为目前治疗终末期肾病的最有效手段。虽然肾移植取得了巨大成功,组织配型技术及新型免疫抑制剂的研发得到了长足发展,肾移植患者术后仍面临着急性排斥反应(acute rejection, AR)的风险。AR的发生大大降低了移植物及受者的存活率,因此,及早诊断并治疗AR显得至关重要。目前临床上诊断AR多依据临床表现和生化指标的改变,如血清肌酐水平上升、尿量减少、体重增加、发热,或伴随出现蛋白尿、血尿等,此时移植肾已出现病理改变,诊断滞后性显而易见。程序性活检能及时发现AR,但由于其属有创性检查,存在一定风险性,在我国尚未能被广泛接受。新的血、尿标记物如细胞间黏附分子21、IL-24、可溶性IL-22R及可溶性CD30等诊断AR多存在敏感性低或特异性不高等问题。新型影像学技术如超声造影及磁共振灌注加权成像(PWIMRI)等可以反映肾脏的形态和血流灌注,监测排斥反应的发生,但是同样存在着滞后性的特点。细胞免疫应答是介导移植肾排斥反应的主要免疫学机制。调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)和辅助性T淋巴细胞(T helper, Th)17均为T淋巴细胞的亚群,二者在移植、自身免疫性疾病、炎症性疾病及肿瘤等免疫相关性疾病中均扮演着重要角色。Treg在维持机体免疫平稳、诱导免疫耐受方面起着重要作用。Thl7则能防御胞外病原菌的感染,介导炎性反应及移植排斥反应。Treg/Th17保持平衡,有利于机体免疫稳态的维持,而如果Treg/Th17失衡,则会导致疾病的发生,在移植方面则可能引起排斥反应的发生。因此,我们期待通过检测外周血Treg/Th17平衡的变化,来找寻一种简便、有效、无创而又特异性地预测急性排斥反应发生的方法。MicroRNAs (miRNAs)是一类近10年来发现的重要的内源性非编码单链小RNA分子,从转录后水平调控靶基因的表达,在生长发育、肿瘤发生及细胞的分化、增殖和凋亡等过程中都发挥了重要作用。miRNAs效应分子参与了免疫反应的各个阶段,与T、B细胞的分化发育及B细胞抗体的类别转换密切相关,具有免疫调控的作用。miRNAs与AR的发生存在密切联系。来自纽约威尔康奈尔医学中心的一项研究发现,在发生AR的移植肾穿刺活检组织中存在着miR-142-5p、miR-155和miR-223等的高表达,提示肾穿刺组织miRNAs的变化可以反映急性排斥反应的发生。因此,我们想到血液中miRNAs的变化亦有可能预测急性排斥反应的发生,并且这种检测是无创的。皮肤移植是目前可行的器官移植中排斥反应最为强烈的模型,因观察周期短、操作简便、手术成功率高、可控性强等诸多优点而被广泛应用于移植模型的建立。我们根据国内外关于皮肤移植的文献报道,选择移植物存活率较高、操作相对简单的方法制作研究所需的小鼠皮肤移植模型,并通过检测不同类型小鼠皮肤移植模型中Treg/Th17平衡及miRNAs的变化,来探索寻找无创检测AR的特异性生物学标记物。目的1.建立小鼠皮肤移植模型。2.研究不同类型小鼠皮肤移植模型中外周血Treg/Th17平衡的变化。3.探讨血液中miRNAs在不同类型小鼠皮肤移植模型的表达水平变化。方法1.建立小鼠背对背皮肤移植模型a)动物分组受者Balb/c小鼠60只,按照体重、年龄和性别相同的情况,随机分为三个大组：自体移植组(对照组)、同种异基因移植组(急性排斥组)和环孢素组(CsA组),每组20只。其中对照组行Balb/c小鼠背部皮肤的自体移植；急性排斥组以C57BL/6为供者小鼠行同种异基因皮肤移植；环孢素组亦以C57BL/6为供者小鼠行同种异基因皮肤移植,并从手术当天开始每天腹腔注射环孢素A (20mg/Kg·d)。对照组和急性排斥组从手术当天开始每天腹腔注射等量0.9%生理盐水作为对照。b)皮肤移植移植物为供者的背部皮肤,移植床为受者的背部。供受者小鼠麻醉后准备移植皮片和移植床,对合完毕,将背部皮片采用6-8针间断缝合固定在受者小鼠背部,凡士林纱布和无菌纱布覆盖,创可贴加压包扎。c)术后观察在行移植术后第7天拆除绷带,观察移植皮片存活情况,用皮片平均存活时间(mean survival time, MS T)表示。若植皮与宿主的背底部愈合,色泽一致,无炎症和充血,有毛的皮肤毛发生长良好,则认为未发生排斥反应。移植皮片发黑,发干,结痂,皱缩等为移植皮片发生排斥反应的表现。当小鼠移植皮片有发生排斥反应的表现,而且排斥面积占小鼠移植皮片总面积的百分比>80%,视为完全排斥。2.研究不同类型小鼠皮肤移植模型中外周血Treg/Th17平衡的变化a)动物分组受者Balb/c小鼠30只,按照体重、年龄和性别相同的情况,随机分为三个大组：自体移植组(对照组)、同种异基因移植组(急性排斥反应组)和环孢素组(CsA组),每组10只。各组处理同前。b)皮肤移植：具体方法同前。c)外周血Treg/Th17的检测分别在皮肤移植术前及术后第1天、第3天、第7天经小鼠眼内眦静脉采血100μ1,肝素抗凝,加入全培溶液、佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)及Golgistop,37℃、5%CO2的培养箱中刺激培养6h,加入FITC Rat Anti-MouseCD4,避光孵育30min,然后行固定打孔,再加入Alexa Fluro 647 Rat Anti-Mouse Foxp3和PE Rat Anti-Mouse IL-17A避光孵育30min,行流式细胞计数分析。3.探讨血液中miRNAs在不同类型小鼠皮肤移植模型的表达水平变化a)动物分组：受者Balb/c小鼠36只,按照体重、年龄和性别相同的情况,随机分为三个大组：自体移植组(对照组)、同种异基因移植组(急性排斥反应组)和环孢素组(CsA组),每组12只。各组处理同前。b)皮肤移植：具体方法同前。c)血液中miRNAs的检测：分别于术前(day 0)、术后第一天(day 1)、术后第三天(day 3)及术后第七天(day 7)每组随机抽取3只小鼠,每只小鼠行心脏采血1ml左右,然后予以处死,血液样本采用EDTA抗凝,-20-C保存。采用miRNA提取试剂盒提取RNA,行逆转录反应,然后采用荧光定量PCR法检测mir-142-5p、mir-155及mir-223的表达量。根据样本扩增曲线图和融解曲线图,测量荧光信号达到设定的阈值所经过的循环次数(Ct值),所得数据采用2-△△ct法进行分析。4. 统计学方法采用SPSS13.0对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(X±s)表示。小鼠皮片生存分析采用近似时序检验(Log-Rank检验),乘积极限法(Kaplan-Meier法)做生存曲线。单因素的组间比较采用单向方差分析,重复测量数据的组间比较采用重复测量数据的方差分析,析因设计资料的组间比较采用析因设计资料的方差分析,多重比较时若满足方差齐性采用Bonferroni法,若方差不齐采用Dunnett’sT3法。以P<0.05为差异有统计学差异。结果1.三组小鼠移植皮片存活状况三组小鼠在移植术后7天拆除绷带后,均无皮片移位和脱落现象。对照组、急性排斥组和环孢素组的中位生存时间分别为大于30天、8天、20天。对照组(自体皮肤移植组)20例移植皮片有18例存活时间大于30天,移植皮片的存活率为90%。三组小鼠间皮片生存时间比较有显著性差异(P=0.000),对照组存活时间较急性排斥组和环孢素组明显延长(χ2=39.112,P=0.000；χ2=15.898,P=0.000),环孢素组较急性排斥组亦明显延长(χ2=35.786,P=0.000)。2.三组小鼠不同时间外周血Treg/Th17平衡的变化不同组间Treg/CD4+T细胞比例没有显著性差异(F=1.987,P=0.157)；不同时间之间的Treg/CD4+T细胞比例亦没有显著性差异(F=1.109,P=0.350)；组别与时间之间的交互效应亦不显著(F=0.221,P=0.969)。不同组间Th17/CD4+T细胞比例没有显著性差异(F=0.513,P=0.605)；不同时间之间的Th17/CD4+T细胞比例亦没有显著性差异(F=1.367,P=0.259)；组别与时间之间的交互效应亦不显著(F=0.188,P=0.979)。不同组间Treg/Th17比例没有显著性差异(F=0.890,P=0.422)；不同时间之间的Treg/Th17比例亦没有显著性差异(F=0.374,P=0.772)；组别与时间之间的交互效应亦不显著(F=0.087,P=0.997)。3. 三组小鼠不同时间血液中三种miRNA的变化不同组间mir-142-5p的相对表达水平有显著性差异(F=15.185,P=0.000)；不同时间之间的mir-142-5p的相对表达水平亦有显著性差异(F=44.018,P=0.000)；组别与时间之间的交互效应显著(F=7.709,P=0.000)。在术后第三天(day3),三组间mir-142-5p的相对表达水平有显著性差异(F=26.490,P=0.001)。急性排斥组较对照组和环孢素组显著升高(P=0.002,P=0.003),而环孢素组和对照组之间无显著性差异(P=1.000)。不同组间mir-155的相对表达水平有显著性差异(F=9.876,P=0.001)；不同时间之间的mir-155的相对表达水平亦有显著性差异(F=11.228,P=0.000)；组别与时间之间的交互效应不显著(F=1.924,P=0.118)。在术后第七天(day7),三组间mir-155的相对表达水平有显著性差异(F=8.002,P=0.020)。急性排斥组较对照组显著升高(P=0.022),与环孢素组之间则无显著性差异(P=0.387),环孢素组与对照组之间亦无明显差异(P=0.201)。不同组间mir-223的相对表达水平无显著性差异(F=1.196,P=0.320)；而不同时间之间的mir-223的相对表达水平有显著性差异(F=13.792,P=0.000)；组别与时间之间的交互效应不显著(F=0.408,P=0.867)。结论1.小鼠外周血Treg、Th17及Treg/Th17在皮肤移植急性排斥反应早期未有明显变化,Treg/Th17平衡不能用于小鼠急性排斥反应的早期预测。2.小鼠血液中mir-142-5p和mir-155在皮肤移植急性排斥反应早期表达升高,可以用于小鼠急性排斥反应的早期预测。3.小鼠血液中mir-223在皮肤移植急性排斥反应早期未有明显升高,不能用于小鼠急性排斥反应的早期预测。