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前言 肝硬化是威胁人类健康的严重疾病，肝纤维化是各种肝病（包括病毒性、酒精性、化学性等）发展成肝硬化的必经之路。肝纤维化的发展是细胞外基质（ECM）合成增加、降解减少的结果。肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化发生的中心环节，HSC是分泌合成胶原的主要细胞。在ECM降解过程中起主要作用的酶类是基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂（TIMPs）和尿激酶原激活系统（uPA和PAI-1）。HSC激活受多种细胞因子的调控如肿瘤坏死因子（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）、血小板源性生长因子（PDGF）等，其中PDGF是最强的促有丝分裂原，TGF-β1为最强的促肝纤维化因子。目前普遍认为，在酒精性肝纤维化和肝硬化形成过程中，HSC起重要作用，HSC体外培养成功为肝纤维化的研究提供了理想的细胞模型。中药复方的多途径、多层次、多靶点的综合药理作用在抗肝纤维化治疗中显示出独特的优势。本研究观察了中药抗纤复方Ⅰ号（KXI）对乙醛处理的体外培养的大鼠HSC增殖、胶原合成、MMPs、TIMPs及PAI-1mRNA的表达和TGF-β1、PDGF分泌的影响，以期阐述KXI抗酒精性肝纤维化的作用机制，为临床酒精性肝病（ALD）的中药治疗提供更多的理论依据。 材料与方法 一、主要材料与仪器 （一）动物为Wistar雄性大鼠。Ⅳ型胶原酶、密度梯度离心介质Nycodenz、NP-40均为Sigma公司产品，链霉蛋白酶为德国Merck公司产品，四甲基偶氮哩蓝（M’IT）为Fluka公司产品，40％乙酸（分析纯）购自中国医药集团上海化学试剂公司，DMEM培养液为美国GeO公司产品。兔抗人结蛋白（Deslnin）抗体、SP组化试剂盒购于福建迈新公司，PClll、LN、HA放射免疫测定试剂盒为上海海军医学研究所产品；RT－PCR试剂盒为hkaa产品，引物均由北京奥科公司合成。双抗体夹心ABC－EllSA试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。 （二）药物与药物血清的制备：抗纤复方互号（主要由丹参、黄茂、红花。汉防己、葛根、桃仁、甘草等药物组成）浓缩口服制剂和生理盐水，给大鼠谁服。无菌条件下由下腔静脉取血，离心取血清。使用时用无血清 DMEM培养液稀释成10％的药物和正常血清孵育液。 （三）酶标仪E－Uza Mat－300：美国产JC－12ho放射免疫Y顺仪：中国产；w’n－100 PCR扩增仪：美国产；ID Kodak成像分析系统：美国产；稳压电泳仪 POWER／NPACJ00：BIO－RAD产品。 二、方法 （一）肝星状细胞分离、培养和鉴定 参照宋少刚等报道的方法分离肝星状细胞。采用链霉蛋白酶及IV型胶原酶对大鼠肝脏进行原位灌流消化，经比扬他以d用E密度梯度离心，吸取界面处的细胞悬浮于20％小牛血清DMEM培养液中，以IX10VInl的浓度接种在塑料培养M里，置CO。培养箱中培养。本次实验采用传2－4代HSC。HSC鉴定方法：将细胞爬片用兔抗人Desndn抗体、SP法作免疫细胞化学染色，胞浆阳染者为HSC。 （二）细胞增殖率测定 采用Mrt比色法，传代的细胞长满单层后用胰酶消化后置20％小牛血清 DMEM培养液中，调整细胞数为 IX10＊L，以每孔 100gi加人96孔培养板内，置 CO。培养箱内预培养72h后，分成正常血清对照组、正常血清十乙醛组及药物血清十乙醛组。每孔100J10％药物血清孵育液，再加人乙醛使之终浓度分别为 100w上00uM300uM。对照血清十乙酸组以同样方法添加正常血清及乙醛。每个浓度设4个复孔，作用 24b后，加人 W液20叶，用酶标仪测其OD值。 （三）放免法测定nlll、LN、HA含量 以 IX10＊瓶浓度接种在培养瓶（25Cm2）中的 HSC长满单层后，分为正 ·2·常血清对照组、正常血清十乙醛组及药物血清十乙醛组。乙醛组加人乙醛后使终浓度为二见刚，血清浓度为10％，培养24h后收集培养上清，每个样品作双复管，严格按说明操作。JC－1200放射免疫Y计数仪上直接测定PClll、LN、HA含量，取均值。 （四）ELISA法检测TGF ＊；和PDGF含量 按方法（三）处理HSC及收集培养上清，每个样品均作复管，严格按说明操作。酶标仪检测OD值。 （五）RT一PCR检测al（I）、al（IV）型胶原，MMP一1、2、9，TIMP一1、2和 PAI人 表达 按方法（三）处理HSC 6h和24h，分另提取总RNA并测定RNA浓度和纯度。2 pgRNA经 BcaBEST Polylnerase逆转录成 cDNA。引物参照文献设计，p－achn作为内参照，PCR扩增条件及产物各有不同（详见论文部分人PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳、摄片、密度扫描，然后用其表达量与对应p－achn的表达量进行比较。 （六）统计学处理 各组数据以均值上标准差k。S）表示，两两均数的比较用t检验。 实验结果 （一）培养大鼠HSCS的鉴定 免疫细胞化学染色显示，传代＊SC纯度＞98％。（见图1－1） （二）乙醛及药物血清对HSC增殖的影响 正常血清浓度为10％时，乙醛浓度为100pM在00pMJ00pM时均对＊SC有增殖作用汗＜o．05人但各浓度间差异无统计学意义，而10％药物血清只对100pM乙醒刺