目的:　　1.利用层层自组装(LBL)技术制备较为理想的明胶-海藻酸钠-壳聚糖多层纳米膜，并与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养，检测其表征。应用3D体外培养体系简单模拟体内肿瘤细胞生长的缺氧微环境，为进一步研究缺氧条件下EMT机制对肿瘤发生发展的作用提供更优越的平台。　　2.选用裸鼠为实验对象，比较传统二维培养条件和三维肿瘤模型下乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤以及迁移情况，初步探讨三维培养模型相比于二维培养模型的优势，为进一步开展对乳腺癌的发生发展以及侵袭性转移的研究提供一定的理论与实验基础。　　方法:　　1.购买人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，常规复苏后用含10％FBS、100U/ml的青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基培养于25cm2培养瓶中，37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养。2-3d传代，传代的细胞分成两组，一组用于传统二维培养，一组与自组装纳米膜混合共培养，构建3D肿瘤组织模型。　　2.从南方医科大学购买BALB/c-nu裸鼠，精心饲养，观察裸鼠精神状态、活动能力等。所有的动物实验都遵守南方医科大学动物实验中心指定的动物相关制度。　　3.3D肿瘤组织模型的构建。人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞以1×106/cm2接种密度接种于75cm2培养瓶中，37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养。隔天换液待细胞融合至80％-90％后用PBS洗两遍，用含0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化，于镜下观察消化情况，待70％细胞变圆脱下时，用完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底细胞，收集细胞悬液，800rmp，5min，离心去上清液，调整细胞数在1×107。收集到的细胞均匀分散到已经预热的1％明胶溶液中(7ml)，细胞材料作用十分钟后，1000rmp，5min，离心去除多余的明胶溶液，此时细胞表面沉积一层阳离子型聚电解质薄膜。然后将预热的0.1％海藻酸钠溶液(7ml)与聚电解质薄膜反应10分钟，1000rmp，5min，离心去除多余的海藻酸钠溶液，得到表面是阴离子的聚电解质薄膜。上述两个步骤重复三次，最后可得到包裹有大量乳腺癌细胞的聚阴离子多层纳米膜。将0.2％壳聚糖溶液(7ml)与等体积RPMI-1640培养基充分混合，pH值调至6.7左右，与聚阴离子多层纳米膜反应10分钟，1000rmp，5min，离心去除多余的壳聚糖溶液，从而形成聚阳离子纳米膜。培养基轻轻重悬纳米膜，后置于六孔板中，37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养，每天换液。培养一天后，将纳米膜转移至另一个孔继续培养。正常二维培养细胞作为对照。取出复合MDA-MB-231乳腺癌细胞的聚电解质纳米膜，PBS清洗三次，予活死染色试剂盒观察纳米膜上细胞的存活状况。2.5％戊二醛固定后，扫描电镜和透射电镜分别观察纳米膜表面以及内部的细胞生长状况。4％多聚甲醛常温固定后冰冻切片做活死染色检测纳米膜内部细胞的活性，免疫荧光检测纳米膜上肿瘤细胞HIF的表达情况。　　4.将培养四天的二维培养的细胞(cells in2D culture)以及从纳米膜上迁移出的细胞（cells migrated from3D culture）用含0.02％ EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化后，收集细胞悬液，分别加入等体积的PBS液和Matrigel胶重悬，充分混匀，用1ml注射器抽取100ul（细胞总数:5×106），左手拇指食指固定裸鼠头部，无名指及小指固定尾巴，右手将细胞悬液注射于裸鼠右裸鼠右胁助部皮下，分别得到移植有二维培养细胞的裸鼠（2D组，5只）和移植有纳米膜上迁出细胞的裸鼠（3Dm，5只）。纳米膜经PBS洗3次，切开裸鼠右侧胸壁皮肤约1.0cm，暴露脂肪垫，将肿瘤球移植入皮下间隙，缝合切口，得到移植有3D肿瘤球的裸鼠（3Di，5只）。每天观察其存活情况、精神活动状态、称体重。每天观察其成瘤状况。肿瘤长出后，隔天观察肿瘤形态，测量裸鼠肿瘤的长径和长径垂直的短径，计算其体积并绘制肿瘤生长曲线。50天后，处死裸鼠，称重肿瘤组织。　　5.裸鼠肿瘤细胞上皮间充质转化的检测。离断颈髓法将裸鼠处死，剥离裸鼠肿瘤组织，保留其包膜，将其置于4％多聚甲醛中固定约24h，冰冻切片后予N-cadherin、E-cadherin蛋白免疫荧光检测。　　6.统计分析采用SPSS13.0统计软件完成，结果用均值±标准差（x±s）来表示。两独立样本均数比较采用独立样本t检验分析，采用Equalityof Variances方法（方差齐）或者Satterthwaite近似t检验方法（方差不齐），p＜0.05表示差异有统计学意义。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐性的组间比较采用Tukey法，方差不齐的组间比较采用Dunnetts T3法，p＜0.05认为差异有统计学意义。　　结果:　　1.通过LBL法构建的多层纳米膜结构呈白色透明状，表面含有大量的细胞，生物相容性好，随着培养时间延长，肿瘤细胞不断从纳米膜中爬出。　　2.扫描电镜结果显示:由纳米膜所形成的多细胞肿瘤球呈多孔性的三维网络结构，网间隙较小，这有利于水分，营养物质及氧气渗透;肿瘤球表面细胞生长良好，细胞与细胞，细胞与细胞外基质之间相互作用，形成肿瘤细胞生长的3D立体环境，组织表面的肿瘤细胞比较理想的粘附在3D材料支架上。　　3.纳米膜表面的活死染色结果显示肿瘤球表面可见少量死亡细胞（红色），肿瘤球呈三维立体结构，生物相容性好。　　4.纳米膜冰冻切片后的活死染色结果可见肿瘤球表面活细胞较多（绿色），而肿瘤球内部则见到大量的死细胞（红色）。免疫荧光检测HIF蛋白表达(568nm激发红光)，CD47蛋白大量表达（488nm激发绿光），DAPI染核（蓝色），可见大量细胞核碎片，边缘不清晰，细胞发生凋亡。正常二维培养组细胞未见HIF表达，DAPI染核（蓝色）清晰。透射电镜结果显示肿瘤球内部细胞出现坏死，脂滴形成。　　5.2D组、3Dm组、3Di组接种肿瘤后第10天，2D组和3Dm组5只裸鼠腋下均出现肿瘤，体积分别为277.86±50.00mm3，72.97±88mm3。2D组和3Dm组肿瘤体积随着时间不断的增长，2D组裸鼠的肿瘤体积明显大于3Dm组裸鼠肿瘤体积，且肿瘤的增长速度快于3Dm组肿瘤。在肿瘤接种后第21天，2D组裸鼠肿瘤体积为1685.87±258.09mm3，3Dm组裸鼠肿瘤体积为486.33±373.98mm3，3Dm组与2D组肿瘤体积有显著性差异(p＜0.05)。肿瘤移植后第29天，2D组裸鼠肿瘤体积为2160.62±17.19mm3，3Dm组裸鼠肿瘤体积为695.90±525.75mm3，3Dm组肿瘤体积明显较2D组肿瘤体积小，且有统计学意义(p＜0.01)。接种后第40天，2D组裸鼠肿瘤体积为3561.47±617.42mm3，3Dm组裸鼠肿瘤体积为939.15±706.74mm3，3Dm组肿瘤体积明显小于2D组肿瘤体积，且有统计学意义(p＜0.01)。接种后26天，3Di组5只裸鼠腋下出现肿瘤，肿瘤很小，不易测量，且生长缓慢。2D组裸鼠肿瘤体积生长速度快，肿瘤出现8天后，裸鼠肿瘤表面出现溃疡坏死。3Dm组有一只裸鼠出现溃疡，而3Di组裸鼠肿瘤表面均未出现溃疡。接种后50天，2D组其中一只裸鼠死亡，实验终止。　　6.接种肿瘤后，三组裸鼠精神状态及活动能力一直很好，未见明显活动异常。2D组裸鼠肿瘤体积后期增长迅速，状态逐渐衰弱。在肿瘤接种50天时，2D组其中一直裸鼠出现死亡，实验终止。取材后，2D组、3Dm裸鼠三只裸鼠均形成具有完整包膜的肿瘤组织，肿瘤重量分别为0.456±0.052g、0.102±0.822g。3Di组裸鼠有一只形成具有完整包膜的肿瘤组织，肿瘤重量为0.031±0.010g。3Dm组和3Di组肿瘤肿瘤无显著差异(p＞0.05)，3Dm组相对于2D组有显著差异(p＜0.05)，同时3Di组裸鼠肿瘤重量也显著小于2D组(p＜0.01)。此外，3Di组另外两只裸鼠皮下出现肿瘤样白色组织，未形成完整包膜。　　7.免疫荧光检测2D组、3Dm组、3Di组肿瘤组织N-cadherin蛋白(568nm激发绿光)和E-cadherin蛋白（488nm激发绿光）表达情况，结果示:2D组N-cadherin蛋白表达强阳性（红色），DAPI染核（蓝色），细胞异型性明显，可见细胞核碎片，核多呈空泡状。3Dm组E-cadherin蛋白强阳性（绿色），DAPI染核（蓝色）清晰;3Di组肿瘤组织N-cadherin蛋白阳性（红色），E-cadherin蛋白阳性（绿色），DAPI染核（蓝色）未见异常;3Di组肿瘤样白色组织E-cadherin蛋白大量表达（绿色），DAPI染核（蓝色）清晰。　　结论:　　1.基于明胶-海藻酸钠-壳聚糖自组装制备的3D体外肿瘤模型具有良好的生物相容性，再现细胞与细胞，细胞与基质之间的相互作用，为细胞的生长提供了一个和体内近乎相似的三维立体的空间结构，并且其可简单模拟体内实体肿瘤微环境中的缺氧状况，更加接近体内完整的肿瘤组织。　　2.在动物水平，3D肿瘤模型不仅模拟了缺氧介导的上皮间充质转化，进而促发的肿瘤侵袭能力增强的过程，而且其所构建的休眠微环境限制了细胞的迅速迁移，起到了休眠屏障的作用，模拟了肿瘤生长所必经的潜伏期阶段，真实再现了体内肿瘤生长的过程，这也更利于我们对乳腺癌发生、发展、转移的研究。